에티오피아에서 SARS-CoV-2를 식별하기 위한 4가지 핵산 증폭 분석 성능

Nature.com을 방문해 주셔서 감사합니다. CSS 지원이 제한된 브라우저 버전을 사용하고 있습니다. 최상의 경험을 위해서는 업데이트된 브라우저를 사용하거나 Internet Explorer에서 호환 모드를 비활성화하는 것이 좋습니다. 또한 지속적인 지원을 보장하기 위해 스타일과 JavaScript가 없는 사이트를 표시합니다.
한 번에 세 개의 슬라이드가 포함된 회전식 슬라이드를 표시합니다. 이전 및 다음 버튼을 사용하여 한 번에 세 개의 슬라이드 사이를 이동하거나 마지막에 있는 슬라이더 버튼을 사용하여 한 번에 세 개의 슬라이드 사이를 이동하십시오.
2019년 코로나바이러스 질병(COVID-19)이 발생한 이후 전 세계적으로 많은 상용 핵산 증폭 검사(NAAT)가 개발되어 표준 분석법이 되었습니다. 여러 가지 테스트가 빠르게 개발되어 실험실 진단 테스트에 적용되었지만 이러한 테스트의 성능은 다양한 환경에서 평가되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 CRS(Composite Reference Standard)를 사용하여 Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI 및 Sansure Biotech 분석의 성능을 평가하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구는 2020년 12월 1일부터 30일까지 에티오피아 공중 보건 연구소(EPHI)에서 수행되었습니다. QIAamp RNA 미니 키트와 Abbott DNA 샘플 준비 시스템을 사용하여 164개의 비인두 샘플을 추출했습니다. 164개 검체 중 CRS 양성은 59.1%, 음성은 40.9%였다. Sansure Biotech의 양성률은 CRS에 비해 유의하게 낮았습니다(p<0.05). Sansure Biotech의 양성률은 CRS에 비해 유의하게 낮았습니다(p<0.05). Sansure Biotech의 연구 결과는 CRS와 관련이 있습니다(p < 0,05). 산슈어바이오텍의 긍정적인 결과는 CRS에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05).与CRS 比，Sansure Biotech 의 阳性率显着较低(p < 0.05).与CRS 比，Sansure Biotech 의 阳性率显着较低(p < 0.05). Sansure Biotech은 CRS에 대한 정보를 제공합니다(p < 0,05). Sansure Biotech은 CRS에 비해 긍정적인 결과가 훨씬 적었습니다(p < 0.05).4가지 분석의 전반적인 일치율은 CRS와 비교하여 96.3~100%였습니다. Sansure Biotech 분석의 낮은 양성률 외에도 4가지 분석의 성능은 거의 비슷했습니다. 따라서 Sansure Biotech [연구 전용(RUO)] 분석법을 에티오피아에서 사용하려면 추가 검증이 필요합니다. 마지막으로, 적절한 제조업체의 주장을 바탕으로 분석법을 평가하기 위해 추가 연구를 고려해야 합니다.
실험실 테스트는 세계보건기구(WHO) 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19) 대비 및 대응(SPRP) 전략 계획의 일부입니다. WHO는 각국이 공중 보건 문제에 대한 대비, 적절한 사례 관리, 경계 및 신속한 대응을 개선하기 위해 실험실 역량을 구축해야 한다고 조언합니다. 이는 실험실의 역할이 새로운 감염원의 질병 및 역학을 특성화하고 확산을 통제하는 데 핵심임을 시사합니다.
코로나19 진단에는 역학 및 의료 정보, 개인 증상/징후, 방사선 사진 및 실험실 데이터가 필요합니다2. 중국 우한에서 코로나19 발병이 보고된 이후 전 세계적으로 많은 상용 핵산 증폭 검사(NAAT)가 개발되었습니다. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(rRT-PCR)은 중증 급성 호흡기 증후군 2(SARS-CoV-2)3 감염의 실험실 진단을 위한 일상적이고 표준적인 방법으로 사용되어 왔습니다. SARS-CoV-2의 분자 검출은 일반적으로 ORF1a/b(오픈 리딩 프레임 1a/b)의 N(뉴클레오캡시드 단백질 유전자), E(외피 단백질 유전자) 및 RdRp(RNA 의존성 RNA 중합효소 유전자) 유전자를 기반으로 합니다. . gene) 바이러스 게놈에서 확인된 영역입니다. 이는 바이러스 인식을 위해 바이러스 게놈에서 발견되는 주요 보존 영역으로 간주됩니다4. 이들 유전자 중 RdRp 및 E 유전자는 분석 검출 민감도가 높은 반면, N 유전자는 분석 민감도가 낮습니다5.
PCR 분석의 성능은 추출 시약, 증폭/검출 시약, 추출 방법, PCR 기계 및 기타 장비의 품질과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 2020년 4월 현재 9개국에서 48개 이상의 다양한 진단 장치가 코로나196 진단에 대한 긴급 사용 승인(EUA)을 받았습니다. 에티오피아에서는 ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 및 Quant-studio7을 포함하여 26개 공공 보건 기관에서 SARS-CoV-2의 PCR 검출을 위해 14개 이상의 실시간 PCR 플랫폼이 사용됩니다. 이 밖에도 다안 유전자 테스트, 애보트 SARS-CoV-2 테스트, 샌슈어바이오텍 테스트, SARS-CoV-2 BGI 테스트 등 다양한 PCR 테스트 키트가 준비되어 있다. rRT-PCR은 매우 민감하지만, 일부 코로나19 환자는 부적절한 수집, 운송, 보관 및 취급, 실험실 테스트로 인해 검체 내 바이러스 리보핵산(RNA) 사본이 부족하여 위음성 결과를 보고합니다. 직원의 상태 및 행동8. 또한 검체 또는 대조군의 잘못된 취급, 주기 역치(Ct) 설정, 다른 병원성 핵산 또는 비활성/잔류 SARS-CoV-2 RNA와의 교차 반응성은 rRT-PCR9 분석에서 위양성 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 PCR 테스트는 실제로 활성화된 바이러스 유전자를 구별할 수 없기 때문에 실제로 유전자 단편의 운반자를 식별할 수 있다는 것이 분명합니다. 따라서 테스트에서는 환자가 아닌 운반자만 식별할 수 있습니다10. 따라서 우리 환경에서 표준 방법을 사용하여 진단 성능을 평가하는 것이 중요합니다. 많은 NAAT 시약이 에티오피아 공중보건연구소(EPHI)와 전국적으로 이용 가능하지만, 그 효과에 대한 비교 평가는 아직 보고되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 임상 검체를 이용한 rRT-PCR을 통한 SARS-CoV-2 검출을 위해 시판되는 키트의 성능을 비교 평가하는 것을 목표로 했습니다.
이번 연구에는 총 164명의 코로나19 의심 참가자가 포함되었습니다. 샘플의 대부분은 치료 센터 출신이었고(118/164 = 72%), 나머지 46명(28%) 참가자는 비치료 센터 출신이었습니다. 센터에서 치료를 받지 않은 참가자 중 임상적으로 의심되는 사례가 15명(9.1%), 확진자와 접촉한 사례가 31명(18.9%)이었다. 93명(56.7%)의 참가자는 남성이었으며, 참가자의 평균(±SD) 연령은 31.10(±11.82)세였습니다.
본 연구에서는 코로나19에 대한 4가지 검사의 양성 및 음성 비율을 결정했습니다. 따라서 Abbott SARS-CoV-2 분석, Daan Gene 2019-nCoV 분석, SARS-CoV-2 BGI 분석 및 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석의 양성률은 각각 59.1%, 58.5%, 57.9% 및 55.5%였습니다. . 양성 및 음성 복합 참조 표준(CRS) 점수는 각각 97(59.1%) 및 67(40.9%)이었습니다(표 1). 본 연구에서는 CRS의 정의는 4개의 검사 결과 중 동일한 결과를 나타내는 2개 이상의 검사 결과를 진양성 또는 음성으로 간주하는 "임의의 양성" 규칙에 기초했습니다.
이 연구에서는 CRS와 비교하여 모든 분석에서 NPA(음성 백분율 일치) 100%(95% CI 94.6–100)를 발견했습니다. Sansure Biotechnology 분석은 93.8%(95% CI 87.2-97.1)의 최소 PPA를 나타냈고 Daan Gene 2019-nCoV 분석은 99.4%(95% CI 96.6-99.9)의 전체 일치율을 보였습니다. 대조적으로 SARS-CoV-2 BGI 분석과 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석 간의 전반적인 일치율은 각각 98.8%와 96.3%였습니다(표 2).
CRS와 Abbott SARS-CoV-2 분석 결과 사이의 Cohen의 카파 일치 계수는 완전히 일관되었습니다(K = 1.00). 마찬가지로 Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI, Sansure Biotech 2019-nCoV에서 검출한 Cohen의 카파 값도 CRS와 완전히 일치합니다(K ≥ 0.925). 이번 비교 분석에서는 카이제곱 테스트(McNemar 테스트)를 통해 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석 결과가 CRS 결과와 유의하게 다른 것으로 나타났다(p=0.031)(Table 2).
그림과 같이1 Abbott SARS-CoV-2 분석(RdRp 및 N 유전자 결합)의 최저 Ct 값(< 20 Ct) 비율은 87.6%였으며 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 비율을 나타냈습니다. Ct 값(< 20 Ct)은 50.3%였으며 높은 Ct 값(36~40 Ct)은 3.2%. 1 Abbott SARS-CoV-2 분석(RdRp 및 N 유전자 결합)의 최저 Ct 값(< 20 Ct) 비율은 87.6%였으며 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 비율을 나타냈습니다. Ct 값(< 20 Ct)은 50.3%였으며 높은 Ct 값(36~40 Ct)은 3.2%.그림과 같이1, процент наименьшего значения Ct(< 20 Ct) 및 Abbott SARS-CoV-2(комбинированный ген RdRp 및 N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct(< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) 3,2%. 도 1에 따르면, Abbott SARS-CoV-2(RdRp와 N 결합 유전자)의 분석에서 가장 낮은 Ct 값(< 20 Ct)이 차지하는 비율은 87.6%였으며, Sansure Biotech 2019-nCoV의 ORF1a/b 유전자 분석에서는 Ct 값이 나타났습니다. 낮은 Ct 값(< 20 Ct)이 50.3%를 차지하고, 높은 Ct 값(36~40 Ct)이 차지하는 비율이 Ct)가 3.2%를 차지했다.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp andN 基因) 的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 적확률 50.3%, 높은 Ct 值(36–40 Ct) 적분율 3.2%입니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 Abbott SARS-CoV-2 테스트(RdRp와 N 유전자의 조합)의 가장 낮은 Ct 값 비율(< 20 Ct)은 87.6%이며 Sansure Biotech 2019-nCoV 테스트의 ORF1a/b 유전자 Ct 값 낮은 Ct值(< 20 Ct) 的 비율은 50.3%, 高Ct를 나타냅니다.值(36–40 Ct) 의 비율은 3.2%입니다. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2(сочетавий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct(< 20 Ct) 87.6%, значение Ct genа ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- ANALIз nCoV показал низкий Ct. 그림 1에 표시된 것처럼 Abbott SARS-CoV-2 분석(RdRp 및 N 유전자 결합)은 87.6%로 가장 낮은 비율의 Ct 값(< 20 Ct)을 보인 반면, Sansure의 ORF1a/b 유전자의 Ct 값은 Biotech 2019 연구 – nCoV 분석 결과 낮은 Ct가 나타났습니다. 가격은 20Ct 미만) 50,3%, 가격은 36–40Ct) 3,2%입니다. 값(< 20 Ct)의 비율은 50.3%였으며, 높은 Ct 값(36~40 Ct)의 비율은 3.2%였습니다.Abbott SARS-CoV-2 B 테스트에서는 Ct 값이 30 이상을 기록했습니다. 반면, BGI SARS-CoV-2 분석에서는 ORF1a/b 유전자의 Ct 값이 높은(> 36 Ct) 비율이 4%였습니다(그림 1). 반면, BGI SARS-CoV-2 분석에서는 ORF1a/b 유전자의 Ct 값이 높은(> 36 Ct) 비율이 4%였습니다(그림 1). С другой стороны, в 분석 BGI SARS-CoV-2 세대 ORF1a/b имел высокое значение Ct(> 36 Ct), процент которого составлял 4%(Rис. 1). 반면, BGI SARS-CoV-2 유전자 ORF1a/b 분석에서는 Ct 값이 높았으며(> 36 Ct), 그 비율은 4%였습니다(그림 1).한 가지 방법으로 BGI SARS-CoV-2 检测中, ORF1a/b의 基因具는 높은 Ct 值(> 36 Ct)의 百分比为4%(图1)입니다. 반면, BGI SARS-CoV-2 검출에서는 Ct 값이 높은(>36 Ct) ORF1a/b 유전자의 비율이 4%입니다(그림 1). С другой стороны는 BGI SARS-CoV-2 프로세서의 ORF1a/b를 분석하여 высокими значениями Ct(>36 Ct) 기준 4%(Rис. 1)를 분석합니다. 반면, BGI SARS-CoV-2 분석에서는 Ct 값이 높은(>36 Ct) ORF1a/b 유전자의 비율이 4%로 나타났다(그림 1).
본 연구에서는 164개의 비인두 샘플을 채취했습니다. 모든 유형의 분석에 대해 각 제조업체가 권장하는 방법과 키트를 사용하여 RNA 분리 및 증폭을 수행했습니다.
이 연구는 SARS-CoV-2에 대한 Abbott의 테스트가 CRS와 동일한 탐지 성능을 가지며 100% 양성, 음성 및 전체 일치성을 입증했습니다. Cohen의 카파 일치도는 1.00으로 CRS와 완전히 일치함을 나타냅니다. 미국 워싱턴대학교의 유사한 연구에서도 애보트의 SARS-CoV-2 검사의 전반적인 민감도와 특이도는 CDC의 실험실 결정 분석법(LDA)에 비해 각각 93%와 100%인 것으로 나타났다. . 11. Abbott SARS-CoV-2 탐지 시스템은 N 및 RdRp 유전자의 동시 결합 탐지를 기반으로 합니다. 두 유전자 모두 더 민감하고 거짓 음성을 최소화하기 때문입니다12. 오스트리아 비엔나에서 진행된 연구에서도 추출 샘플 용량과 검출 용리액 용량이 크면 희석 효과가 최소화되고 검출 효율성이 향상되는 것으로 나타났습니다13. 따라서 SARS-CoV-2 분석에 대한 Abbott의 완벽한 일치는 조합 유전자를 동시에 검출하고, 다수의 샘플(0.5 ml)을 추출하며, 다량의 용리액(40 µl)을 사용하는 플랫폼 검출 시스템과 연관될 수 있습니다.
우리의 결과는 또한 Daan 유전자 검사의 검출 성능이 CRS의 검출 성능과 거의 동일하다는 것을 보여주었습니다. 이는 중국 화이난(Huainan)의 안후이대학교(Anhui University)에서 실시한 연구14 및 100% 긍정적인 동의를 주장하는 제조업체의 주장과 일치합니다. 일관된 결과 보고에도 불구하고, 동일한 용출액을 재검사한 후 한 샘플은 위음성이었지만 Abbott SARS-CoV-2 및 Sansure Biotech nCoV-2019 분석에서는 양성이었습니다. 이는 다양한 유형의 분석에 따라 결과에 변동이 있을 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 중국에서 수행된 연구에서 Daan Gene 분석 결과는 실험실에서 정의한 참조 분석과 크게 달랐습니다(p < 0.05). 그럼에도 불구하고 중국에서 수행된 연구에서 Daan Gene 분석 결과는 실험실에서 정의한 참조 분석과 크게 달랐습니다(p < 0.05). Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их 분석기 분석. 그러나 중국의 한 연구에서는15 Daan Gene의 분석 결과가 실험실 참조 분석과 크게 달랐습니다(p<0.05).然而, 에서 중국의 여행 중 15, 大安基因检测的结果与其实验室室比有显着差异 (p < 0.05).然而, 中國进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室室室义 参考检测比有显着差 <0.05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравненив с его эталонным labouratорным тестом. 그러나 중국의 한 연구에서15 Daan의 유전자 검사 결과는 참조 실험실 검사와 크게 달랐습니다(p<0.05).이러한 불일치는 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 참조 테스트의 민감도 때문일 수 있으며, 원인을 파악하려면 추가 연구가 중요할 수 있습니다.
또한, 본 연구에서는 SARS-CoV-2 BGI 분석법과 CRS의 비교 성능을 평가했는데, 우수한 양성 일치율(PPA = 97.9%), 음성 일치율(NPA = 100%), 성별에 따른 전반적인 일치율( OPA). ). = 98.8%). Cohen의 Kappa 값은 좋은 일치를 보였습니다(K=0.975). 네덜란드16 및 중국15의 연구에서는 일관된 결과가 나타났습니다. SARS-CoV-2 BGI 테스트는 10μl 증폭/검출 용출액을 사용하는 단일 유전자(ORF1a/b) 검출 테스트입니다. 기준 결과와 통계적으로 잘 일치함에도 불구하고 분석에서는 전체 샘플 중 두 개의 긍정적인 샘플(1.22%)이 누락되었습니다. 이는 환자와 지역 사회 수준 모두에서 전염 역학에 큰 임상적 영향을 미칠 수 있습니다.
이 연구에 포함된 또 다른 비교 분석은 Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR(RUO) 분석이었습니다. 전체 일치율은 96.3%였습니다. 합의 강도는 Cohen's Kappa 값에 의해 결정되었으며, 이는 0.925로 CRS와 완전히 일치함을 나타냅니다. 다시 말하지만, 우리의 결과는 중국 창사의 Central South University 및 중국 Liuzhou시 Liuzhou People's Hospital의 임상 실험실에서 수행된 연구와 동일합니다17. 위와 같이 좋은 통계적 일치성을 기록했음에도 불구하고 카이제곱 검정(MacNemar test) 결과 Sansure Biotech 분석 결과는 CRS와 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.005). 위와 같이 좋은 통계적 일치성을 기록했음에도 불구하고 카이제곱 검정(MacNemar test) 결과 Sansure Biotech 분석 결과는 CRS와 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее statистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравненив с CRS(p < 0,005). 위와 같이 좋은 통계적 일치도를 기록하였음에도 불구하고 카이제곱 검정(McNemar test) 결과 Sansure Biotech 분석 결과가 CRS와 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS显着差异(p < 0.005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 , 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， , sansure biotech 检测 结果 与 crs 比 具有显着 （p<0.005。。。。。。。。。。。。。。。。 Несмотря на отмеченное выше хорошее statisticiстическое соответствие, Критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал 통계는 Sansure Biotech 및 CRS와 관련이 있습니다. (p < 0,005) 위에서 언급한 우수한 통계적 일치에도 불구하고 카이제곱 테스트(McNemar 테스트)에서는 Sansure Biotech 분석과 CRS 간에 통계적으로 유의한 차이(p < 0.005)가 나타났습니다.CRS(보충 표 1)와 비교하여 6개 샘플(3.66%)이 위음성인 것으로 나타났습니다. 이는 특히 바이러스 전염의 역학을 고려할 때 매우 중요합니다. 위의 데이터도 이러한 낮은 탐지율15을 뒷받침합니다.
본 연구에서는 Ct 값이 각 분석 및 해당 플랫폼에 대해 결정되었으며, Abbott SARS-CoV-2 분석에서 보고된 평균 Ct 값이 가장 낮았습니다. 이 결과는 SARS-CoV-2 검출을 위한 Abbott의 동시 통합 유전자 검사 시스템과 관련이 있을 수 있습니다. 따라서 그림 1에 따르면 Abbott SARS-CoV-2 결과의 87.6%는 Ct 값이 20 미만이었습니다. 소수의 샘플 결과(12.4%)만이 20~30 범위에 있었습니다. 30 이상의 Ct 값은 기록되지 않았습니다. Abbott가 SARS-CoV-2 패널 유전자 검사 형식을 사용하는 것 외에도 이 결과는 회사의 하한인 100 RNA 사본보다 3배 낮은 검출 하한치(32.5 RNA 사본/mL)와 관련이 있을 수 있습니다. /mL. ml)19.
이 연구에는 몇 가지 제한점이 있습니다. 첫째, 자원 부족으로 인해 표준/참조 방법[예: 바이러스 부하 또는 기타 실험실 테스트(LDA)]이 없습니다. 둘째, 본 연구에 사용된 검체는 모두 비인두 면봉으로 제작되었으며, 다른 검체 유형에는 결과가 적용되지 않았다는 점, 셋째, 표본 크기가 작았다는 점이다.
이 연구에서는 비인두 샘플을 사용하여 SARS-CoV-2에 대한 4가지 rRT-PCR 분석의 성능을 비교했습니다. Sansure Biotech 분석을 제외하고 모든 검출 분석은 거의 비슷한 성능을 보였습니다. 또한 Sansure Biotech 분석에서는 CRS에 비해 낮은 양성률이 확인되었습니다(p<0.05). 또한 Sansure Biotech 분석에서는 CRS에 비해 낮은 양성률이 확인되었습니다(p<0.05). 크림은 Sansure Biotech이 CRS에 대해 테스트를 진행한 결과를 보여줍니다(p < 0,05). 또한 산슈어바이오텍 테스트는 CRS에 비해 낮은 양성 결과 비율을 보였다(p<0.05).此외, 与CRS 比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05).此외, 与CRS 比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05). 크림은 Sansure Biotech이 CRS에 대한 정보를 제공하기 위해 노력하고 있음을 보여줍니다(p < 0,05). 또한 Sansure Biotech 분석은 CRS에 비해 양성률이 낮았습니다(p<0.05).PPA, NPA 및 전반적인 일치도에 대한 Sansure Biotech nCoV-2019(RUO) 분석은 Cohen Kappa 일치 강도 값 0.925로 93.5%를 초과했습니다. 마지막으로, RUO(Sansure Biotech Assay)는 에티오피아에서 사용하기 위해 추가 검증이 필요하며 개별 제조업체의 주장을 평가하기 위해 추가 연구를 고려해야 합니다.
비교 연구 설계는 아디스 아바바의 4개 의료 시설, Eka Kotebe 병원, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital 및 St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital에서 수행되었습니다. 데이터는 2020년 12월 1일부터 31일 사이에 수집되었습니다. 이 연구를 위한 의료 시설은 사례 수가 많고 도시 내 주요 치료 센터의 가용성을 기반으로 의도적으로 선택되었습니다. 마찬가지로 ABI 7500 및 Abbott m2000 실시간 PCR 기기를 포함한 기기는 NAAT 시약 제조업체의 권장 사항에 따라 선택되었으며 에티오피아의 대부분의 실험실에서는 최소한 최소한 그 중 4개. 유전자 테스트, Abbott SARS-CoV-2 테스트, Sansure Biotech 테스트 및 SARS-CoV-2 BGI 테스트가 연구 기간 동안 수행되었습니다.
SARS-CoV-2에 대한 테스트는 2020년 12월 1일부터 30일까지 EPHI에 언급된 COVID-19 조사 대상 개인의 바이러스 수송 매체(VTM)(Miraclean Technology, 중국 심천) 3ml를 사용하여 수행되었습니다. 비인두 샘플은 훈련된 샘플 수집가가 수집하여 3중 팩에 담아 EPHI로 보냈습니다. 핵산 분리에 앞서 각 샘플에는 고유 식별 번호가 할당됩니다. 수동 및 자동 추출 방법을 사용하여 도착 즉시 각 샘플에서 추출이 수행됩니다. 따라서 Abbott m2000의 자동 추출을 위해 각 시료에서 시료 1.3ml(Dead Volume 0.8ml, 추출 Inlet Volume 0.5ml 포함)를 추출하여 Abbott DNA Sample Preparation System(Abbott Molecular Inc. des Plaines, 일리노이, 미국). ) 96개 배치(샘플 92개, 검출 컨트롤 2개, 비템플릿 컨트롤(NTC) 2개)가 SARS-CoV-2(EUA) 2회차의 전체 프로세스(검색 및 검출)에 실시간으로 포함되었습니다. 채광. 마찬가지로 수동 추출의 경우에도 동일한 샘플을 사용합니다(자동 추출 및 검색용). 따라서 전체 과정에서 140μl 샘플을 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 사용하여 9회에 걸쳐 24개 배치(20개 샘플, 2개 분석 대조군 및 2개 NTC 포함)로 분취하고 추출했습니다. 수동으로 추출된 용출액은 SARS-CoV-2 BGI 분석, Daan Gene 분석 및 Sansure Biotech 분석을 사용하는 ABI 7500 열순환기를 사용하여 증폭 및 검출되었습니다.
SARS-CoV-2 바이러스 RNA의 자동 분리 및 정제는 Abbott DNA 샘플 준비 시약을 사용하여 자기 비드 원리를 따릅니다. 샘플의 불활성화 및 바이러스 입자의 용해는 구아니딘 이소티오시아네이트를 함유한 세제를 사용하여 수행되어 단백질을 변성시키고 RNase를 비활성화합니다. 그런 다음 RNA는 실리카, 즉 구아니디늄염을 사용한 고상 분리에 의해 단백질로부터 분리되며, 용해 완충액의 알칼리성 pH는 핵산과 실리카(SiO2)의 결합을 촉진합니다. 헹굼 단계에서는 남은 단백질과 잔해물을 제거하여 투명한 용액을 생성합니다. 투명한 RNA는 기기의 자기장을 사용하여 실리카 기반 미세 입자로부터 분리됩니다. 반면, RNA의 수동 분리 및 정제는 마그네틱 스탠드 대신 원심분리를 사용하고 용리액에서 미세입자를 분리하는 스핀 컬럼 방법으로 수행됩니다.
Abbott 실시간 SARS-CoV-2 검출 테스트(Abbott Molecular, Inc.)는 WHO 및 FDA로부터 EUA19,22를 받은 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서는 추출 전 샘플 비활성화를 56°C의 수조에서 30분 동안 수행했습니다. 바이러스 불활성화 후, Abbott m2000 DNA 샘플 준비 시스템을 사용하여 0.5ml VTM에서 Abbott m2000 SP 장비로 핵산 추출을 수행했습니다. 제조업체에 따르면. 증폭 및 검출은 Abbott m2000 RT-PCR 장비를 사용하여 수행되었으며, RdRp 및 N 유전자에 대해 이중 검출이 수행되었습니다. 내부 대조군의 표적화 및 검출을 위한 ROX) 및 VIC P(고유 염료)로 두 증폭 산물을 동시에 검출할 수 있습니다 19 .
본 키트의 증폭 검출 방법은 One-Step RT-PCR 기술을 기반으로 합니다. ORF1a/b 및 N 유전자는 표적 영역 증폭을 검출하기 위해 Daan Gene Technology에 의해 보존 영역으로 선택되었습니다. 특정 프라이머와 형광 프로브(FAM으로 표지된 N 유전자 프로브, VIC로 표지된 ORF1a/b 프로브)는 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하도록 설계되었습니다. 최종 용리액과 마스터 믹스는 5μl의 용리액을 20μl의 마스터 믹스에 첨가하여 최종 부피가 25μl가 되도록 준비했습니다. 증폭 및 검출은 ABI 750024 실시간 PCR 장비에서 동시에 수행되었습니다.
ORF1a/b 및 N 유전자는 Sansure Biotech nCoV-2019 핵산 진단 키트(형광 PCR 검출)를 사용하여 검출되었습니다. ORF1a/b 영역에 대한 FAM 채널과 N 유전자에 대한 ROX 채널을 선택하여 각 표적 유전자에 대한 특정 프로브를 준비합니다. 이 분석 키트에는 용리액과 마스터 믹스 시약이 다음과 같이 추가됩니다. 마스터 믹스 시약 30μl와 검출/증폭을 위한 용출 샘플 20μl를 준비합니다. 실시간 PCR ABI 750025를 증폭/검출에 사용했습니다.
SARS-CoV-2 BGI 테스트는 코로나19 진단을 위한 형광 실시간 rRT-PCR 키트입니다. 표적 부위는 SARS-CoV-2 게놈의 ORF1a/b 부위에 위치해 있으며, 이는 단일 유전자 검출 방법이다. 또한, 인간 하우스키핑 유전자인 β-액틴은 내부적으로 조절되는 표적 유전자이다. 마스터 믹스 시약 20μl와 추출된 RNA 샘플 10μl를 웰 플레이트에 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다. ABI 7500 형광 정량적 실시간 PCR 기기를 증폭 및 검출에 사용했습니다. 모든 핵산 증폭, 각 분석에 대한 PCR 실행 조건 및 결과 해석은 해당 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다(표 3).
이 비교 분석에서는 네 가지 분석에 대한 일치율(긍정적, 부정적 및 전체) 및 기타 비교 매개변수를 결정하기 위해 참조 표준 방법을 사용하지 않았습니다. 각 테스트 비교는 CRS를 사용하여 수행되었습니다. 이 연구에서 CRS는 "모든 양성" 규칙에 따라 설정되었으며 결과는 단일 테스트가 아닌 최소 2개의 일치하는 테스트 결과를 사용하여 결정되었습니다. 또한, 코로나19 전파의 경우, 위양성 결과보다 위음성 결과가 더 위험합니다. 따라서 CRS 결과에서 최대한 정확하게 "양성"이라고 말하려면 최소한 두 가지 분석 테스트가 양성이어야 합니다. 즉, EUA 분석에서 최소한 하나의 양성 결과가 나올 가능성이 있다는 의미입니다. 따라서 4개의 테스트 결과 중 동일한 결과를 나타내는 2개 이상의 테스트 결과가 참양성 또는 음성으로 간주됩니다18,27.
데이터는 구조화된 데이터 추출 양식을 사용하여 수집되었으며, 데이터 입력 및 분석은 기술통계용 Excel 통계 소프트웨어 및 SPSS 버전 23.0을 사용하여 수행되었습니다. 긍정, 부정 및 전체 일치율을 분석하고 Kappa 점수를 사용하여 각 방법과 CRS의 일치 정도를 결정했습니다. Kappa 값은 다음과 같이 해석됩니다: 0.01~0.20은 가벼운 동의, 0.21~0.40은 일반적 동의, 0.41~0.60은 중간 동의, 0.61~0.80은 주요 동의, 0.81~0.99는 완전한 동의입니다28.
아디스 아바바 대학교에서 윤리적 승인을 얻었으며 이 연구에 대한 모든 실험 프로토콜은 에티오피아 공중 보건 연구소의 과학 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. EPHI 윤리 라이센스의 참조 번호는 EPHI/IRB-279-2020입니다. 모든 방법은 코로나19 치료를 위한 에티오피아 국가 종합 지침의 권장 사항 및 조항에 따라 적용되었습니다. 또한 연구에 참여하기 전에 모든 연구 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.
이 연구에서 획득하거나 분석한 모든 데이터는 이 출판된 기사에 포함되어 있습니다. 이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 합당한 요청이 있을 경우 각 저자에게 제공됩니다.
세계보건기구. COVID-19에 대한 실험실 테스트 전략에 대한 권장 사항: 임시 지침, 2020년 3월 21일 No. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1(WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI 응급실의 코로나19 스마트 진단: 올인 인 실천. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI 응급실의 코로나19 스마트 진단: 올인 인 실천.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. 및 Gurgulianis, KI 응급실의 지능형 코로나19 진단: 실제 모든 것.Muliou DS, Pantazopoulos I. 및 Gurgulyanis KI 응급실의 코로나19 지능형 진단: 실제로 엔드투엔드 통합. 전문가인 Respire 목사님. 약. 3, 263–272(2022).
Mitchell, SL & St George, K. COVID19 ID NOW EUA 분석 평가. Mitchell, SL & St George, K. COVID19 ID NOW EUA 분석 평가.Mitchell, SL 및 St. George, K. COVID19 ID NOW EUA 분석 평가.Mitchell SL 및 St. George K. COVID19 ID NOW EUA 분석 평가. J. 임상. 바이러스. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. 의심되는 인간 질병에서 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 실험실 검출. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (2020년 8월 15일 접속) (WHO, 2020).
Udugama, B.et al. 코로나19 진단: 질병 및 테스트 도구. ACS Nano 14(4), 3822-3835(2020).
Syed S. et al. 동부, 중앙 및 남부 아프리카 병리학 대학 설립 - 중동 및 남아프리카 지역 병리학 학교. 아프리카. 제이랩. 약. 9(1), 1-8(2020).
연방 보건부 산하 에티오피아 공중 보건 연구소. 코로나19 실험실 진단을 위한 임시 국가 전략 및 지침. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (2020년 8월 12일 접속) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS SARS-CoV-2 감염 문제 및 영향에 대한 거짓 음성 테스트. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS SARS-CoV-2 감염 문제 및 영향에 대한 거짓 음성 테스트.Voloshin S., Patel N. 및 Kesselheim AS SARS-CoV-2 감염 및 그 결과에 대한 위음성 테스트.Voloshin S., Patel N. 및 Kesselheim AS 도발 및 SARS-CoV-2 감염의 영향에 대한 위음성 테스트. N.eng. J. 의학. 383(6), e38(2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI 위양성 및 위음성 코로나19 사례: 호흡기 예방 및 관리 전략, 예방 접종 및 추가 관점. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI 위양성 및 위음성 코로나19 사례: 호흡기 예방 및 관리 전략, 예방 접종 및 추가 관점. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактика и стратегии лечения, вакцинация 및 dalнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI 코로나19의 위양성 및 위음성 사례: 호흡기 예방 및 치료 전략, 예방 접종 및 앞으로 나아갈 길.Muliu, DS 및 Gurgulianis, KI 코로나19의 위양성 및 위음성 사례: 호흡기 예방 및 치료, 예방 접종 및 앞으로 나아갈 길을 위한 전략. 전문가인 Respire 목사님. 약. 15(8), 993-1002(2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. 응급실의 코로나19 진단: 나무는 보였지만 숲은 사라졌습니다. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. 응급실의 코로나19 진단: 나무는 보였지만 숲은 사라졌습니다.Mouliou, DS, Ioannis, P. 및 Konstantinos, G. 응급실의 코로나19 진단: 나무를 보고 숲을 잃습니다.Muliou DS, Ioannis P. 및 Konstantinos G. 응급실의 코로나19 진단: 나무를 위한 숲이 충분하지 않습니다. 나타나다. 약. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Abbott RealTime SARS-CoV-2 분석의 분석 및 임상 성능에 대한 검증 및 검증. J. 임상. 바이러스. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 기존 RT-PCR을 통한 바이러스 감염 탐지를 위한 코로나19의 다양한 게놈 영역에서 가져온 5개 프라이머 세트를 비교합니다. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 기존 RT-PCR을 통한 바이러스 감염 탐지를 위한 코로나19의 다양한 게놈 영역에서 가져온 5개 프라이머 세트 비교.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. 및 Aflatunyan, B. 기존 RT-PCR을 통한 바이러스 감염 검출을 위한 코로나19 게놈의 다양한 영역에서 가져온 5개 프라이머 세트 비교. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19는 서로 다른 5종의 동물입니다.检测病毒感染. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 기존 RT-PCR을 통한 바이러스 감염 탐지를 위한 COVID-19의 5개 유전 영역 비교.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. 및 Aflatunyan B. 기존 RT-PCR을 통한 바이러스 감염 탐지를 위한 코로나19 게놈의 다양한 영역에서 가져온 5개 프라이머 세트 비교.이란. J. 미생물학. 12(3), 185(2020).
Goertzer, I. et al. SARS-CoV-2 게놈 서열 검출을 위한 국가 외부 품질 평가 프로그램의 예비 결과. J. 임상. 바이러스. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스에 대한 5가지 RT-PCR 키트의 효능에 대한 분석적 평가 2. J. Clinical. 실혐실. 항문. 35(1), e23643(2021).
Wang B. et al. 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)을 기반으로 중국에서 시판되는 7개의 SARS-CoV-2 RNA 검출 키트를 평가합니다. 객관적인. 화학적인. 실혐실. 약. 58(9), e149–e153(2020).
반 카스테렌(van Casteren), PB 외. 상용 RT-PCR 코로나19 진단 키트 7개 비교. J. 임상. 바이러스. 128, 104412(2020).
루, 유, 그 외 여러분. SARS-CoV-2 핵산 검출을 위한 두 가지 PCR 키트의 진단 성능 비교. J. 임상. 실혐실. 항문. 34(10), e23554(2020).
Lefart, PR 등 4개 SARS-CoV-2 핵산증폭검사(NAAT) 플랫폼을 비교한 연구 결과, ID NOW 성능은 환자와 샘플 유형에 따라 크게 저하되는 것으로 나타났다. 진단. 미생물학. 감염. 디스. 99(1), 115200(2021).
애보트 분자. Abbott 실시간 SARS-CoV-2 분석 패키지 삽입물. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (2020년 8월 10일 현재) (2020).
Klein, S.et al. RT-qPCR 및 RT-LAMP를 통한 신속한 대규모 검출을 위해 자기 비드를 사용한 SARS-CoV-2 RNA 분리. 바이러스 12(8), 863(2020).