에티오피아에서 SARS-CoV-2를 식별하기 위한 4가지 핵산 증폭 분석 수행

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2019년 코로나바이러스 질병(COVID-19) 발병 이후, 전 세계적으로 많은 상업용 핵산 증폭 검사(NAAT)가 개발되어 표준 검사가 되었습니다. 여러 검사가 빠르게 개발되어 실험실 진단 검사에 적용되었지만, 이러한 검사의 성능은 다양한 환경에서 평가되지 않았습니다. 따라서 이 연구는 복합 참조 표준(CRS)을 사용하여 Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI 및 Sansure Biotech 검사의 성능을 평가하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구는 2020년 12월 1일부터 30일까지 에티오피아 공중보건원(EPHI)에서 수행되었습니다. QIAamp RNA 미니 키트와 Abbott DNA 샘플 준비 시스템을 사용하여 164개의 비인두 샘플을 추출했습니다. 164개의 검체 중 59.1%는 CRS에 대해 양성이고 40.9%는 음성이었습니다. Sansure Biotech의 양성률은 CRS에 비해 유의하게 낮았습니다(p < 0.05). Sansure Biotech의 양성률은 CRS에 비해 유의하게 낮았습니다(p < 0.05). Sansure Biotech의 연구 결과는 CRS와 관련이 있습니다(p < 0,05). Sansure Biotech의 긍정적인 결과는 CRS에 비해 유의하게 낮았습니다(p < 0.05).与CRS 比，Sansure Biotech 의 阳性率显着较低(p < 0.05).与CRS 比，Sansure Biotech 의 阳性率显着较低(p < 0.05). Sansure Biotech은 CRS에 대한 정보를 제공합니다(p < 0,05). Sansure Biotech는 CRS에 비해 긍정적인 결과가 유의하게 적었습니다(p < 0.05).네 가지 분석의 전반적인 일치도는 CRS와 비교하여 96.3~100%였습니다. Sansure Biotech 분석법의 낮은 양성률 외에도, 네 가지 분석법의 성능은 거의 유사했습니다. 따라서 Sansure Biotech [연구용(RUO)] 분석법은 에티오피아에서 사용하기 위해서는 추가적인 검증이 필요합니다. 마지막으로, 적절한 제조사의 주장을 뒷받침하는 분석법을 평가하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
실험실 검사는 세계보건기구(WHO)의 2019년 코로나바이러스 감염증(COVID-19) 대비 및 대응 전략 계획(SPRP)의 일부입니다. WHO는 각국이 대비 태세 강화, 적절한 사례 관리, 경계 태세 강화, 그리고 공중보건 문제에 대한 신속한 대응을 위해 실험실 역량을 구축해야 한다고 권고합니다. 이는 실험실의 역할이 신종 감염원의 질병 및 역학을 규명하고 확산을 통제하는 데 핵심적임을 시사합니다.
COVID-19 진단에는 역학 및 의학적 정보, 개인 증상/징후, 방사선 및 실험실 데이터가 필요합니다.2 중국 우한에서 COVID-19 발병이 보고된 이후 전 세계적으로 많은 상업용 핵산 증폭 검사(NAAT)가 개발되었습니다. 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(rRT-PCR)은 중증 급성 호흡기 증후군 2(SARS-CoV-2)3 감염의 실험실 진단을 위한 일상적이고 표준적인 방법으로 사용되었습니다.SARS-CoV-2의 분자 검출은 일반적으로 ORF1a/b(오픈 리딩 프레임 1a/b) 유전자) 영역에서 확인된 N(뉴클레오캡시드 단백질 유전자), E(외피 단백질 유전자), RdRp(RNA 의존성 RNA 중합효소 유전자) 유전자를 기반으로 합니다.이들은 바이러스 인식을 위해 바이러스 게놈에서 발견되는 주요 보존 영역으로 간주됩니다.이러한 유전자 중 RdRp 및 E 유전자는 분석 검출 민감도가 높은 반면 N 유전자는 분석 민감도가 낮습니다.5.
PCR 검사의 성능은 추출 시약, 증폭/검출 시약, 추출 방법, PCR 장비의 품질 및 기타 장비 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 2020년 4월 현재, 9개국에서 48개 이상의 다양한 진단 장비가 COVID-196 진단을 위한 긴급 사용 승인(EUA)을 받았습니다. 에티오피아에서는 ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000, Quant-studio7을 포함하여 26개 공공 보건 기관에서 14개 이상의 실시간 PCR 플랫폼이 SARS-CoV-2 PCR 검출에 사용되고 있습니다. 또한, Daan Gene 검사, Abbott SARS-CoV-2 검사, Sansure Biotech 검사, SARS-CoV-2 BGI 검사 등 다양한 PCR 검사 키트가 제공됩니다. rRT-PCR은 매우 민감하지만, 일부 COVID-19 환자는 부적절한 채취, 운송, 보관 및 취급, 그리고 실험실 검사로 인해 검체 내 바이러스 리보핵산(RNA) 사본이 부족하여 위음성 결과를 보고합니다.8. 또한 검체 또는 대조군의 잘못된 취급, 사이클 임계값(Ct) 설정, 그리고 다른 병원성 핵산 또는 비활성/잔류 SARS-CoV-2 RNA와의 교차 반응성은 rRT-PCR9 검사에서 위양성 결과로 이어질 수 있습니다. 따라서 PCR 검사는 실제로 유전자 단편의 보균자를 식별할 수 있지만, 실제로 활성 바이러스 유전자를 구별할 수 없기 때문에 보균자만 식별할 수 있고 환자는 식별할 수 없다는 것이 분명합니다.10 따라서 우리 환경에서는 표준 방법을 사용하여 진단 성능을 평가하는 것이 중요합니다. 에티오피아 공중보건원(EPHI)과 전국에서 많은 NAAT 시약을 사용할 수 있지만, 그 효과에 대한 비교 평가는 아직 보고되지 않았습니다. 따라서 본 연구는 임상 검체를 사용하여 rRT-PCR을 통해 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 상용 키트의 비교 성능을 평가하는 것을 목표로 합니다.
이 연구에는 COVID-19 의심 환자 총 164명이 포함되었습니다. 표본의 대부분은 치료 센터(118/164 = 72%)에서 수집되었으며, 나머지 46명(28%)은 비치료 센터 출신이었습니다. 센터에서 치료받지 않은 참가자 중 15명(9.1%)은 임상적으로 의심 사례가 있었고 31명(18.9%)은 확진자의 접촉자가 있었습니다. 참가자 중 93명(56.7%)은 남성이었으며, 참가자의 평균(± SD) 연령은 31.10세(± 11.82)였습니다.
이 연구에서는 COVID-19에 대한 네 가지 검사의 양성 및 음성률을 결정했습니다. 따라서 Abbott SARS-CoV-2 분석법, Daan Gene 2019-nCoV 분석법, SARS-CoV-2 BGI 분석법 및 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석법의 양성률은 각각 59.1%, 58.5%, 57.9% 및 55.5%였습니다. 양성 및 음성 복합 참조 표준(CRS) 점수는 각각 97점(59.1%)과 67점(40.9%)이었습니다(표 1). 이 연구에서 CRS는 "모든 양성" 규칙에 따라 정의되었으며, 네 가지 검사 결과 중 동일한 결과를 나타내는 두 개 이상의 검사 결과가 있는 경우 진양성 또는 진음성으로 간주했습니다.
본 연구에서는 CRS와 비교했을 때 모든 분석에서 100%(95% CI 94.6–100)의 음성 일치율(NPA)을 확인했습니다. Sansure Biotechnology 분석은 최소 PPA 93.8%(95% CI 87.2–97.1)를 보였고, Daan Gene 2019-nCoV 분석은 전체 일치율이 99.4%(95% CI 96.6–99.9)였습니다. 반면, SARS-CoV-2 BGI 분석과 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석의 전체 일치율은 각각 98.8%와 96.3%였습니다(표 2).
CRS와 Abbott SARS-CoV-2 검사 결과 간의 코헨 카파 일치 계수는 완전히 일치했습니다(K = 1.00). 마찬가지로, Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI, Sansure Biotech 2019-nCoV에서 검출된 코헨 카파 값도 CRS와 완전히 일치했습니다(K ≥ 0.925). 이 비교 분석에서 카이제곱 검정(McNemar 검정) 결과, Sansure Biotech 2019-nCoV 검사 결과는 CRS 결과와 유의미한 차이를 보였습니다(p = 0.031)(표 2).
그림에서 보는 바와 같이,1 Abbott SARS-CoV-2 assay(RdRp와 N 유전자 결합)의 가장 낮은 Ct 값(< 20 Ct) 백분율은 87.6%였고 Sansure Biotech 2019-nCoV assay의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 Ct 값(< 20 Ct) 백분율이 50.3%였고 높은 Ct 값(36–40 Ct)은 3.2%였습니다. 1 Abbott SARS-CoV-2 assay(RdRp와 N 유전자 결합)의 가장 낮은 Ct 값(< 20 Ct) 백분율은 87.6%였고 Sansure Biotech 2019-nCoV assay의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 Ct 값(< 20 Ct) 백분율이 50.3%였고 높은 Ct 값(36–40 Ct)은 3.2%였습니다.그림에서 보는 바와 같이,1, процент наименьшего значения Ct(< 20 Ct) 및 Abbott SARS-CoV-2(комбинированный ген RdRp 및 N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct(< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) 3,2%. 1, Abbott SARS-CoV-2(RdRp 유전자와 N 결합)의 가장 낮은 Ct 값(< 20 Ct) 분석 백분율은 87.6%이고, Sansure Biotech 2019-nCoV의 ORF1a/b 유전자 분석 Ct 값은 낮은 Ct 값(< 20 Ct) 백분율이 50.3%를 차지하고, 높은 값의 Ct(36–40 Ct)가 3.2%를 차지하는 것으로 나타났습니다.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp andN 基因) 的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 적확률 50.3%, 높은 Ct 值(36–40 Ct) 적분율 3.2%입니다. 그림 1에서 보는 바와 같이 Abbott SARS-CoV-2 검사(RdRp와 N 유전자 조합)의 가장 낮은 Ct 값 백분율(< 20 Ct)은 87.6%이고, Sansure Biotech 2019-nCoV 검사의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 Ct(< 20 Ct) 백분율이 50.3%, 높은 Ct(36–40 Ct) 백분율이 3.2%입니다. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2(сочетавий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct(< 20 Ct) 87.6%, значение Ct genа ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- ANALIз nCoV показал низкий Ct. 그림 1에서 볼 수 있듯이 Abbott SARS-CoV-2 검사(RdRp 및 N 유전자 결합)는 87.6%로 가장 낮은 백분율 Ct 값(< 20 Ct)을 보였지만 Sansure Biotech 2019 연구에서 ORF1a/b 유전자의 Ct 값은 – nCoV 분석에서 낮은 Ct를 보였습니다. 가격은 20Ct 미만) 50,3%, 가격은 36–40Ct) 3,2%입니다. 20 Ct 미만의 값의 비율은 50.3%였고, 높은 Ct 값(36~40 Ct)의 비율은 3.2%였다.Abbott SARS-CoV-2 B 검사는 30 이상의 Ct 값을 기록했습니다. 반면, BGI SARS-CoV-2 검정에서 ORF1a/b 유전자는 높은 Ct 값(> 36 Ct)을 보였으며 백분율은 4%였다(그림 1). 반면, BGI SARS-CoV-2 검정에서 ORF1a/b 유전자는 높은 Ct 값(> 36 Ct)을 보였으며 백분율은 4%였다(그림 1). С другой стороны, в 분석 BGI SARS-CoV-2 세대 ORF1a/b имел высокое значение Ct(> 36 Ct), процент которого составлял 4%(Rис. 1). 반면, BGI SARS-CoV-2 유전자 ORF1a/b의 분석에서는 높은 Ct 값(>36 Ct)을 보였으며, 그 비율은 4%였다(그림 1).한 가지 방법으로 BGI SARS-CoV-2 检测中, ORF1a/b의 基因具는 높은 Ct 值(> 36 Ct)의 百分比为4%(图1)입니다. 반면, BGI SARS-CoV-2 검출에서는 높은 Ct 값(>36 Ct)을 나타내는 ORF1a/b 유전자의 비율이 4%이다(그림 1). С другой стороны는 BGI SARS-CoV-2 프로세서의 ORF1a/b를 분석하여 высокими значениями Ct(>36 Ct) 기준 4%(Rис. 1)를 분석합니다. 반면, BGI SARS-CoV-2 분석에서는 높은 Ct 값(>36 Ct)을 갖는 ORF1a/b 유전자의 비율이 4%였다(그림 1).
본 연구에서는 164개의 비인두 검체를 채취했습니다. 모든 유형의 분석에 대해 각 제조업체에서 권장하는 방법과 키트를 사용하여 RNA 분리 및 증폭을 수행했습니다.
이 연구는 Abbott의 SARS-CoV-2 검사가 100% 양성, 음성 및 전체 일치도로 CRS와 동일한 검출 성능을 가지고 있음을 보여주었습니다. Cohen의 카파 일치도는 1.00으로 CRS와 완전히 일치함을 나타냅니다. 미국 워싱턴 대학교의 유사 연구에서는 Abbott 검사의 SARS-CoV-2에 대한 전반적인 민감도와 특이도가 CDC의 실험실 결정 검정(LDA)과 비교하여 각각 93%와 100%인 것으로 나타났습니다. 11. Abbott SARS-CoV-2 검출 시스템은 N 및 RdRp 유전자의 동시 결합 검출을 기반으로 하는데, 두 유전자 모두 더 민감하여 거짓 음성을 최소화하기 때문입니다. 12 오스트리아 비엔나의 한 연구에서도 대량의 추출 샘플 용량과 검출 용출액 용량이 희석 효과를 최소화하고 검출 효율을 높인다는 것이 밝혀졌습니다. 13 따라서 SARS-CoV-2 검사에 대한 Abbott의 완벽한 조합은 조합 유전자를 동시에 감지하고, 많은 수의 샘플(0.5ml)을 추출하고, 많은 양의 용출액(40µl)을 사용하는 플랫폼 감지 시스템과 연관될 수 있습니다.
본 연구 결과는 다안 유전자 검사의 검출 성능이 CRS 검사와 거의 동일함을 보여주었습니다. 이는 중국 화이난 안후이대학교에서 수행된 연구14 및 제조사가 주장하는 100% 양성 일치율과 일치합니다. 일관된 결과 보고에도 불구하고, 한 샘플은 동일한 용출액을 재검사한 결과 위음성으로 나왔지만, 애보트 SARS-CoV-2 및 산슈어 바이오텍 nCoV-2019 검사에서는 양성으로 나왔습니다. 이는 검사 유형에 따라 결과에 차이가 있을 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, 중국에서 수행된 연구15에서 Daan Gene 분석 결과는 실험실에서 정의한 기준 분석과 비교하여 유의하게 달랐습니다(p < 0.05). 그럼에도 불구하고, 중국에서 수행된 연구15에서 Daan Gene 분석 결과는 실험실에서 정의한 기준 분석과 비교하여 유의하게 달랐습니다(p < 0.05). Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их 분석기 분석. 그러나 중국15의 한 연구에서 Daan Gene의 분석 결과는 실험실 참조 분석과 유의하게 달랐습니다(p < 0.05).然而, 에서 중국의 여행 중 15, 大安基因检测的结果与其实验室室比有显着差异 (p < 0.05).然而, 中國进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室室室义 参考检测比有显着差 <0.05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравненив с его эталонным labouratорным тестом. 그러나 중국15의 한 연구에 따르면, 단의 유전자 검사 결과는 참조 실험실 검사 결과와 유의미하게 달랐습니다(p < 0.05).이러한 불일치는 SARS-CoV-2를 검출하는 기준 검사의 민감도에 기인할 수 있으며, 원인을 파악하기 위해서는 추가 연구가 중요할 수 있습니다.
또한, 본 연구에서는 SARS-CoV-2 BGI 검사와 CRS의 비교 성능을 평가하여 우수한 양성 일치율(PPA = 97.9%), 음성 일치율(NPA = 100%), 그리고 성별별 전체 일치율(OPA)을 나타냈습니다. = 98.8%). 코헨 카파 값은 양호한 일치율(K = 0.975)을 보였습니다. 네덜란드16와 중국15에서 진행된 연구에서도 일관된 결과가 나타났습니다. SARS-CoV-2 BGI 검사는 10 µl 증폭/검출 용출액을 사용하는 단일 유전자(ORF1a/b) 검출 검사입니다. 본 연구의 기준 결과와 통계적으로 일치도가 높았음에도 불구하고, 전체 검체 중 양성 검체 2개(1.22%)가 누락되었습니다. 이는 환자 및 지역사회 수준에서 전파 역학에 임상적으로 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
본 연구에 포함된 또 다른 비교 분석은 Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR(RUO) 분석법이었습니다. 전체 일치율은 96.3%였습니다. 일치도 강도는 Cohen's Kappa 값 0.925로 CRS와 완전히 일치함을 나타냈습니다. 다시 한번 말씀드리지만, 본 연구의 결과는 중국 창사 중남대학교 및 중국 류저우시 류저우 인민병원 임상검사실에서 수행된 연구 결과와 동일합니다.17 위의 좋은 통계적 일치성이 기록되었지만, 카이제곱 검정(MacNemar 검정) 결과 Sansure Biotech 검정 결과는 CRS와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났습니다(p < 0.005). 위의 좋은 통계적 일치성이 기록되었지만, 카이제곱 검정(MacNemar 검정) 결과 Sansure Biotech 검정 결과는 CRS와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났습니다(p < 0.005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее statистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравненив с CRS(p < 0,005). 위의 통계적 일치도는 양호했지만, 카이제곱 검정(McNemar 검정) 결과, Sansure Biotech 검정 결과는 CRS와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다(p < 0.005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS显着差异(p < 0.005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 , 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， , sansure biotech 检测 结果 与 crs 比 具有显着 （p<0.005。。。。。。。。。。。。。。。。 Несмотря на отмеченное выше хорошее statisticiстическое соответствие, Критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал 통계는 Sansure Biotech 및 CRS와 관련이 있습니다. (p < 0,005) 위에서 언급한 좋은 통계적 일치에도 불구하고, 카이제곱 검정(McNemar 검정)은 Sansure Biotech 검정과 CRS 사이에 통계적으로 유의미한 차이(p < 0.005)를 보여주었습니다.6개 샘플(3.66%)이 CRS(보충 표 1)와 비교하여 위음성으로 나타났습니다. 이는 특히 바이러스 전파 역학을 고려할 때 매우 중요합니다. 위 데이터 또한 이러한 낮은 검출률을 뒷받침합니다.15
이 연구에서는 각 분석법과 해당 플랫폼에 대한 Ct 값을 측정했으며, Abbott SARS-CoV-2 분석법에서 가장 낮은 평균 Ct 값이 보고되었습니다. 이 결과는 SARS-CoV-2 검출을 위한 Abbott의 동시 복합 유전자 검사 시스템과 관련이 있을 수 있습니다. 따라서 그림 1에 따르면 Abbott SARS-CoV-2 결과의 87.6%가 Ct 값이 20 미만이었습니다. 소수의 샘플 결과(12.4%)만이 20-30 범위에 있었습니다. 30을 초과하는 Ct 값은 기록되지 않았습니다. Abbott가 SARS-CoV-2 패널 유전자 검사 형식을 사용한 것 외에도 이 결과는 회사의 하한값인 100 RNA copies/mL보다 3배 낮은 하한값(32.5 RNA copies/mL)18과 관련이 있을 수 있습니다.
본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 자원 부족으로 인해 표준/참조 방법(바이러스 수치 또는 기타 실험실 검사(LDA) 등)을 사용할 수 없습니다. 둘째, 본 연구에 사용된 모든 검체는 비인두 면봉 검체였으며, 다른 검체 유형에는 결과를 적용할 수 없었습니다. 셋째, 표본 크기가 작았습니다.
본 연구에서는 비인두 검체를 이용하여 SARS-CoV-2에 대한 네 가지 rRT-PCR 분석법의 성능을 비교했습니다. Sansure Biotech 분석을 제외한 모든 검출 분석법은 거의 유사한 성능을 보였습니다. 게다가 Sansure Biotech 분석에서는 CRS에 비해 양성률이 낮은 것으로 확인되었습니다(p < 0.05). 게다가 Sansure Biotech 분석에서는 CRS에 비해 양성률이 낮은 것으로 확인되었습니다(p < 0.05). 크림은 Sansure Biotech이 CRS에 대해 테스트를 진행한 결과를 보여줍니다(p < 0,05). 또한, Sansure Biotech 검사는 CRS에 비해 양성 결과 비율이 낮았습니다(p < 0.05).此외, 与CRS 比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05).此외, 与CRS 比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0.05). 크림은 Sansure Biotech이 CRS에 대한 정보를 제공하기 위해 노력하고 있음을 보여줍니다(p < 0,05). 또한, Sansure Biotech 검사법은 CRS에 비해 양성률이 낮았습니다(p < 0.05).Sansure Biotech nCoV-2019(RUO)의 PPA, NPA 및 전체 일치도 분석 결과는 Cohen Kappa 일치도 0.925로 93.5%를 초과했습니다. 마지막으로, Sansure Biotech Assay(RUO)는 에티오피아에서의 사용에 대한 추가 검증이 필요하며, 각 제조사의 주장을 평가하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
비교 연구 설계는 아디스아바바의 4개 의료 시설, 에카 코테베 병원, 밀레니엄 교회 치료 센터, 제우디투 기념 병원, 성 베드로 결핵 전문 병원에서 실시되었습니다.자료는 2020년 12월 1일에서 31일 사이에 수집되었습니다.이 연구를 위한 의료 시설은 사례 수가 많고 도시에 주요 치료 센터가 있다는 점을 고려하여 의도적으로 선택되었습니다.마찬가지로 ABI 7500 및 Abbott m2000 실시간 PCR 기기를 포함한 기기는 NAAT 시약 제조업체의 권장 사항에 따라 선택되었으며, 에티오피아의 대부분 실험실에서 최소 4개 이상을 사용했기 때문에 이 연구를 위해 4개의 PCR 검출 키트를 선택했습니다.연구 기간 동안 유전자 검사, Abbott SARS-CoV-2 검사, Sansure Biotech 검사, SARS-CoV-2 BGI 검사를 수행했습니다.
영어: SARS-CoV-2에 대한 검사는 2020년 12월 1일부터 30일까지 EPHI에 의뢰된 COVID-19에 대한 조사를 받는 개인의 Viral Transport Medium(VTM)(Miraclean Technology, Shenzhen, China) 3ml를 사용하여 수행되었습니다. 비인두 검체는 훈련된 검체 수집자가 수집하여 3중 팩으로 EPHI로 보냈습니다. 핵산 분리 전에 각 검체에 고유한 식별 번호가 지정됩니다. 각 검체는 도착 즉시 수동 및 자동 추출 방법을 사용하여 추출을 수행합니다. 따라서 Abbott m2000의 자동 추출을 위해 각 검체에서 1.3ml(0.8ml의 데드 볼륨과 0.5ml의 추출 입구 볼륨 포함)의 검체를 추출하여 Abbott DNA Sample Preparation System(Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA)을 통과시켰습니다. ) 96개의 배치[92개의 샘플, 2개의 검출 대조군 및 2개의 비템플릿 대조군(NTC)]가 실시간으로 진행되는 2라운드의 SARS-CoV-2(EUA)의 전체 프로세스(검색 및 검출)에 포함되었습니다. 마이닝. 마찬가지로 수동 추출의 경우 동일한 샘플을 사용합니다(자동 추출 및 발견). 따라서 프로세스 전체에서 140µl 샘플을 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 9라운드에 걸쳐 24개 배치(샘플 20개, 검정 대조군 2개 및 NTC 2개 포함)로 나누어 추출했습니다. 수동으로 추출한 용출액은 SARS-CoV-2 BGI 분석, Daan Gene 분석 및 Sansure Biotech 분석을 사용하는 ABI 7500 열 순환기를 사용하여 증폭 및 검출했습니다.
SARS-CoV-2 바이러스 RNA의 자동 분리 및 정제는 Abbott DNA 샘플 전처리 시약을 사용하는 자기 비드 원리를 따릅니다. 샘플의 불활성화 및 바이러스 입자의 용해는 단백질을 변성시키고 RNase를 불활성화하기 위해 구아니딘 이소티오시아네이트를 함유한 세제를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음, 실리카(즉, 구아니디늄염)를 사용한 고체상 분리를 통해 RNA를 단백질로부터 분리하고, 용해 완충액의 알칼리성 pH는 핵산과 실리카(SiO2)의 결합을 촉진합니다. 헹굼 단계에서는 잔류 단백질과 잔여물을 제거하여 투명한 용액을 얻습니다. 투명한 RNA는 기기의 자기장을 사용하여 실리카 기반 미립자에서 분리합니다. 반면, RNA의 수동 분리 및 정제는 자기 스탠드 대신 원심분리를 사용하고 용리액에서 미립자를 분리하는 스핀 컬럼 방법을 사용합니다.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test(Abbott Molecular, Inc.)는 WHO와 FDA로부터 EUA19,22를 받은 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 추출 전 샘플 불활성화는 56°C의 수조에서 30분 동안 수행되었습니다. 바이러스 불활성화 후, 핵산 추출은 Abbott m2000 DNA 샘플 준비 시스템을 사용하여 0.5ml VTM에서 Abbott m2000 SP 기기에서 수행되었습니다. 제조업체에 따르면. 증폭 및 검출은 Abbott m2000 RT-PCR 기기를 사용하여 수행되었으며 RdRp 및 N 유전자에 대해 이중 검출이 수행되었습니다. ROX) 및 VIC P(전용 염료)를 사용하여 내부 대조군을 타겟팅하고 검출하여 두 증폭 생성물을 동시에 검출할 수 있습니다 19 .
이 키트의 증폭 검출 방법은 원스텝 RT-PCR 기술을 기반으로 합니다. ORF1a/b 및 N 유전자는 Daan Gene Technology에서 보존 영역으로 선택하여 표적 영역 증폭을 검출했습니다. 특정 프라이머와 형광 프로브(FAM으로 표지된 N 유전자 프로브, VIC로 표지된 ORF1a/b 프로브)는 샘플 내 SARS-CoV-2 RNA를 검출하도록 설계되었습니다. 최종 용출액과 마스터 믹스는 마스터 믹스 20 µl에 용출액 5 µl를 첨가하여 최종 용적이 25 µl가 되도록 준비했습니다. 증폭과 검출은 ABI 750024 실시간 PCR 장비를 사용하여 동시에 수행했습니다.
ORF1a/b 및 N 유전자는 Sansure Biotech nCoV-2019 핵산 진단 키트(형광 PCR 검출)를 사용하여 검출했습니다. ORF1a/b 영역에는 FAM 채널을, N 유전자에 대해서는 ROX 채널을 선택하여 각 표적 유전자에 대한 특정 프로브를 준비했습니다. 이 분석 키트에 용출액과 마스터 믹스 시약을 다음과 같이 첨가했습니다. 검출/증폭을 위해 마스터 믹스 시약 30 µl와 용출된 샘플 20 µl를 준비했습니다. 증폭/검출에는 실시간 PCR ABI 750025를 사용했습니다.
SARS-CoV-2 BGI 검사는 COVID-19 진단을 위한 형광 실시간 rRT-PCR 키트입니다. 표적 영역은 SARS-CoV-2 유전체의 ORF1a/b 영역에 위치하며, 이는 단일 유전자 검출 방법입니다. 또한, 인간 하우스키핑 유전자인 β-액틴은 내부적으로 조절되는 표적 유전자입니다. 마스터 믹스는 웰 플레이트26에서 마스터 믹스 시약 20 µl와 추출된 RNA 샘플 10 µl를 혼합하여 준비합니다. 증폭 및 검출에는 ABI 7500 형광 정량 실시간 PCR 기기를 사용했습니다. 모든 핵산 증폭, 각 분석의 PCR 실행 조건 및 결과 해석은 해당 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다(표 3).
이 비교 분석에서 우리는 4가지 분석에 대한 일치율(양성, 음성 및 전체)과 다른 비교 매개변수를 결정하기 위해 참조 표준 방법을 사용하지 않았습니다.각 검사 비교는 CRS로 수행되었으며, 이 연구에서 CRS는 "모든 양성" 규칙에 의해 설정되었고 결과는 단일 검사가 아닌 최소 두 개의 일치하는 검사 결과를 사용했습니다.또한 COVID-19 전파의 경우 거짓 음성 결과가 거짓 양성 결과보다 더 위험합니다.따라서 CRS 결과에서 가능한 한 정확하게 "양성"이라고 말하려면 최소 두 개의 검사 결과가 양성이어야 하며, 이는 최소 하나의 양성 결과가 EUA 검사에서 나올 가능성이 있음을 의미합니다.따라서 네 개의 검사 결과 중 동일한 결과를 제공하는 두 개 이상의 검사 결과가 진양성 또는 음성으로 간주됩니다18,27.
자료는 구조화된 데이터 추출 양식을 사용하여 수집되었으며, 데이터 입력 및 분석은 Excel 통계 소프트웨어와 SPSS 버전 23.0(기술 통계)을 사용하여 수행되었습니다. 긍정적, 부정적, 그리고 전반적인 일치율을 분석했으며, 각 방법과 CRS의 일치도를 확인하기 위해 카파 점수를 사용했습니다. 카파 값은 다음과 같이 해석됩니다. 0.01~0.20은 경미한 일치, 0.21~0.40은 전반적인 일치, 0.41~0.60은 중간 일치, 0.61~0.80은 주요 일치, 0.81~0.99는 완전 일치입니다.28
아디스아바바 대학교의 윤리 승인을 받았으며, 본 연구의 모든 실험 프로토콜은 에티오피아 공중보건연구소(EPHI)의 과학윤리심의위원회(Scientific Ethics Review Board)의 승인을 받았습니다. EPHI 윤리 허가 번호는 EPHI/IRB-279-2020입니다. 모든 방법은 에티오피아 국가 COVID-19 치료 종합 지침의 권고 및 규정을 준수하여 적용되었습니다. 또한, 연구 참여 전 모든 연구 참여자에게 서면 동의를 구했습니다.
본 연구에서 수집 또는 분석된 모든 데이터는 본 논문에 포함되어 있습니다. 본 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 적절한 요청 시 해당 저자에게 제공될 수 있습니다.
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