에티오피아에서 SARS-COV-2를 확인하기위한 4 개의 핵산 증폭 분석의 성능

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2019 년 코로나 바이러스 질병 (Covid-19)이 발발 한 이후, 많은 상업용 핵산 증폭 시험 (NAAT)이 전 세계적으로 개발되어 표준 분석이되었습니다. 여러 테스트가 신속하게 개발되어 실험실 진단 테스트에 적용되었지만 이러한 테스트의 성능은 다양한 환경에서 평가되지 않았습니다. 따라서이 연구는 복합 참조 표준 (CRS)을 사용하여 Abbott SARS-Cov-2, Daan Gene, BGI 및 Sansure Biotech Assays의 성능을 평가하는 것을 목표로했습니다. 이 연구는 2020 년 12 월 1 일부터 30 일까지 에티오피아 공중 보건 연구소 (EPHI)에서 수행되었다. 164 비 인두 샘플은 QIAAMP RNA 미니 키트 및 Abbott DNA 샘플 준비 시스템을 사용하여 추출되었다. 164 개의 표본 중 59.1%가 양성이고 40.9%는 CR에 대해 음성이었다. Sansure Biotech 양성은 CRS에 비해 상당히 낮았다 (P <0.05). Sansure Biotech 양성은 CRS에 비해 상당히 낮았다 (P <0.05). положительные реезульта 방법은 산업 바이오 테크 미치 미치 미치 미치고 б 제공자입니다. Sansure Biotech의 긍정적 인 결과는 CRS에 비해 상당히 낮았습니다 (p <0.05).CRS 相比 相比, SANSURE BIOTECH 的阳性率显着较低 (P <0.05 릿CRS 相比 相比, SANSURE BIOTECH 的阳性率显着较低 (P <0.05 릿 у sansure biotech ecteech б 담근 бельно мень ше поло칭 rель듈 результататов по сравнению с crs (p <0,05). Sansure Biotech는 CRS에 비해 긍정적 인 결과가 상당히 적었습니다 (p <0.05).4 가지 분석의 전체 합의는 CRS에 비해 96.3-100%였습니다. Sansure Biotech 분석의 낮은 양성 속도 외에도, 4 가지 분석의 성능은 거의 비슷했습니다. 따라서, Sansure Biotech [Research Only (RUO)] 분석은 에티오피아에서의 사용에 대한 추가 검증이 필요합니다. 마지막으로, 적절한 제조업체의 주장으로 분석을 평가하기 위해 추가 연구를 고려해야합니다.
실험실 테스트는 세계 보건기구 (WHO) 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 준비 및 대응 (SPRP)의 전략 계획의 일부입니다. 누가 국가는 준비, 적절한 사례 관리, 경계 및 공중 보건 문제에 대한 신속한 대응을 개선하기 위해 실험실 역량을 구축해야한다고 조언합니다. 이것은 실험실의 역할이 신흥 감염제의 질병과 역학을 특성화하고 그들의 확산을 제어하는 ​​데 중요하다는 것을 시사합니다.
COVID-19의 진단에는 역학 및 의학적 정보, 개인 증상/징후, 방사선 및 실험실 데이터가 필요합니다. Covid-19가 중국 우한에서보고 된 이후, 전 세계적으로 많은 상업용 핵산 증폭 시험 (NAAT)이 개발되었습니다. 실시간 역전사 폴리머 라제 연쇄 반응 (RRT-PCR)은 심한 급성 호흡기 증후군 2 (SARS-COV-2) 3 감염의 실험실 진단을위한 일상 및 표준 방법으로 사용되어왔다. SARS-COV-2의 분자 검출은 전형적으로 ORF1A/B (오픈 리딩 프레임 1A/B)에서 N (Nucleocapsid 단백질 유전자), E (Envelope Protein Gene) 및 RDRP (RNA- 의존성 RNA 중합체 유전자 유전자) 유전자에 기초한다. 바이러스 게놈으로부터 확인 된 유전자) 영역. 이들은 바이러스 인식을 위해 바이러스 성 게놈에서 발견되는 주요 보존 영역으로 간주됩니다 4. 이들 유전자 중에서, RDRP 및 E 유전자는 높은 분석적 검출 감도를 갖는 반면, N 유전자는 분석적 감도가 낮다 5.
PCR 분석의 성능은 추출 시약, 증폭/검출 시약, 추출 방법, PCR 기계의 품질 및 기타 기기와 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 2020 년 4 월 현재 9 개국의 48 개 이상의 서로 다른 진단 장치가 Covid-196 진단에 대한 응급 사용 승인 (EUA)을 받았습니다. 에티오피아에서는 ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 및 Quant-Studio7을 포함한 26 개의 공중 보건 기관에서 SARS-COV-2의 PCR 검출에 14 개 이상의 실시간 PCR 플랫폼이 사용됩니다. 또한, DAAN Gene Test, Abbott SARS-Cov-2 Test, Sansure Biotech Test 및 SARS-COV-2 BGI 테스트와 같은 다양한 PCR 테스트 키트를 사용할 수 있습니다. RRT-PCR이 매우 민감하지만, COVID-19 환자는 부적절한 수집, 운송, 보관 및 취급 및 실험실 테스트로 인해 샘플에서 바이러스 성 리보 핵산 (RNA)의 불충분함에 따라 허위 부정적인 결과를보고합니다. 인원의 조건과 행동 8. 또한, 샘플 또는 제어 불화, 사이클 임계 값 (CT) 설정 및 다른 병원성 핵산과의 교차 반응성 또는 비활성/잔류 SARS-COV-2 RNA는 RRT-PCR9 분석에서 거짓 양성 결과를 초래할 수있다. 따라서, PCR 시험은 진정으로 활성 바이러스 유전자를 구별 할 수 없기 때문에 유전자 단편의 담체를 실제로 식별 할 수 있다는 것이 명백하다. 따라서 시험은 환자가 아닌 운반체 만 식별 할 수있다. 따라서 설정에서 표준 방법을 사용하여 진단 성능을 평가하는 것이 중요합니다. 에티오피아 공중 보건 연구소 (EPHI)와 전국의 많은 NAAT 시약을 이용할 수 있지만 그 효과에 대한 비교 평가는 아직보고되지 않았습니다. 따라서,이 연구는 임상 표본을 사용하여 RRT-PCR에 의한 SARS-COV-2의 검출을위한 시판 된 키트의 비교 성능을 평가하는 것을 목표로했다.
COVID-19가 의심되는 총 164 명의 참가자 가이 연구에 포함되었습니다. 대부분의 샘플은 치료 센터 (118/164 = 72%)에서 나온 반면, 나머지 46 명 (28%)은 비 치료 센터 출신이었습니다. 센터에서 치료받지 않은 참가자 중 15 명 (9.1%)은 임상 적으로 의심되는 경우가 있었고 31 명 (18.9%)은 확인 된 사례의 접촉을 가졌다. 참가자 92 명 (56.7%)은 남성이었고 참가자의 평균 (± SD) 연령은 31.10 (± 11.82) 연도였습니다.
이 연구에서, Covid-19에 대한 4 개의 테스트의 양성 및 음성 비율이 결정되었다. 따라서, Abbott SARS-COV-2 분석, DAAN 유전자 2019-NCOV 분석, SARS-COV-2 BGI 분석 및 SANSURE BIOTECH 2019-NCOV 분석의 양성 속도는 각각 59.1%, 58.5%, 57.9% 및 55.5%였다. 양성 및 음성 복합 기준 표준 (CRS) 점수는 각각 97 (59.1%) 및 67 (40.9%)이었다 (표 1). 이 연구에서 CRS의 정의는 "긍정적 인"규칙을 기반으로했으며, 4 개의 테스트 결과 중에서도 동일한 결과를 제공 한 두 개 이상의 테스트 결과가 진정한 긍정적이거나 부정적인 것으로 간주되었습니다.
이 연구에서 우리는 CRS와 비교하여 모든 분석에 대해 100% (95% CI 94.6–100)의 마이너스 백분율 계약 (NPA)을 발견했습니다. Sansure Biotechnology 분석은 93.8% (95% CI 87.2-97.1)의 최소 PPA를 보여 주었고 DAAN Gene 2019-NCOV 분석은 전체적으로 99.4% (95% CI 96.6-99.9)의 일치를 나타 냈습니다. 대조적으로, SARS-COV-2 BGI 분석과 SANSURE BIOTECH 2019-NCOV 분석 간의 전반적인 합의는 각각 98.8% 및 96.3%였다 (표 2).
CRS와 Abbott SARS-Cov-2 분석 결과 사이의 Cohen의 카파 계수 계수는 완전히 일관되었다 (k = 1.00). 마찬가지로, DAAN Gene 2019-NCOV, SARS-COV-2 BGI 및 Sansure Biotech 2019-NCOV에 의해 검출 된 Cohen의 Kappa 값도 CRS와 완전히 일치합니다 (K ≥ 0.925). 이 비교 분석에서, 카이-제곱 테스트 (McNemar Test)는 Sansure Biotech 2019-NCOV 분석 결과가 CRS 결과와 유의하게 다르다는 것을 보여 주었다 (p = 0.031) (표 2).
그림과 같이.1 Abbott SARS-COV-2 분석 (<20 ct)의 가장 낮은 CT 값 (<20 ct)의 비율은 87.6% 및 ORF1A/B 유전자 CT 값 2019-NCOV assay의 ORF1A/B 유전자 CT 값은 낮은 CT 값 (<20 CT)의 백분율이 50.3%이고 높은 CT 값 (36-40 CT)의 비율이 3.2% 였음을 보여 주었다. 1 Abbott SARS-COV-2 분석 (<20 ct)의 가장 낮은 CT 값 (<20 ct)의 비율은 87.6% 및 ORF1A/B 유전자 CT 값 2019-NCOV assay의 ORF1A/B 유전자 CT 값은 낮은 CT 값 (<20 CT)의 백분율이 50.3%이고 높은 CT 값 (36-40 CT)의 비율이 3.2% 였음을 보여 주었다.그림과 같이.1, прорент наимен있어 · значения CT (<20 ct) анали다는 Abbott Sars-Cov-2 (комбинированн 제공 ген Rdrp и и n) состаил 87,6%, rа а а 제공 orf1a/b анализа sansure biotech 2019-ncov показло что процент низкого значения ct (<20 ct) составля 문제 50,3%, rа Â 40 ct (36-40 ct). составляло 3,2%. 1, Abbott SARS-COV-2 (결합 유전자 RDRP 및 N)의 가장 낮은 CT 값 (<20 ct) 분석의 백분율은 87.6%였고, SANSURE BIOTECH 2019-NCOV의 ORF1A/B 유전자 분석의 CT 값은 50.3%에 대한 낮은 CT 값 (<20 CT)의 비율이 적합 함을 보여 주었다. 3.2%.Abbott SARS-Cov-2 检测 检测 检测 检测 检测 检测 检测 结合 结合 rdrp 和 n 基因 ← 的最低 ct 值百分比 − (<20 ct) 为 87.6%, Sansure Biotech 2019-ncov 检测的 ORF1A/B 基因 ct 值显示低 ct 值 (<20 ct) 的百分比为 50.3%(36 – 40 ct) 도 1에 도시 된 바와 같이, Abbott SARS-COV-2 시험 (RDRP 및 N 유전자의 조합)의 가장 낮은 CT 값 백분율 (<20 ct)은 87.6%, SANSURE BIOTECH 2019-NCOV 검사의 ORF1A/B 유전자 CT 값은 낮은 CT 值 (<20 CT) restage를 보여줍니다. 찾고 показано на рисунке 1, анализ abbott sars-cov-2 (сочета은 гены rdrp и n) имел самое н했다. 87,6%, а · · · · · · · · · · · · · · Â · · Â · · а · Â · · Â · Â · · а · Â · Â · Â · Â · Â · Â · Â · Â · Â · Â · Â · а · Â · Â · а а 익 ссс낙체 산업 바이오 테크 바이오 테크 2019- анализ ncov пока л низкий ct. 도 1에 도시 된 바와 같이, Abbott SARS-COV-2 분석 (RDRP 및 N 유전자를 조합)은 87.6%에서 CT 값 (<20 CT)이 가장 낮은 반면, Sansure Biotech 2019 연구에서 ORF1A/B 유전자의 CT 값은 낮은 CT를 보여 주었다. пронент значений (<20 ct) составил 50,3%, а процент высоких значений ct (36–40 ct) составил 3,2%. 값 (<20 ct)의 백분율은 50.3%였고 높은 CT 값 (36–40 ct)의 백분율은 3.2%였습니다.Abbott SARS-COV-2 B 테스트는 CT 값을 30 이상으로 기록했습니다. 한편, BGI SARS-COV-2 분석에서 ORF1A/B 유전자는 CT 값이 높았다 (> 36ct) 백분율은 4%였다 (도 1). 한편, BGI SARS-COV-2 분석에서 ORF1A/B 유전자는 CT 값이 높았다 (> 36ct) 백분율은 4%였다 (도 1). с другой стороны, Â анализе bgi sars-cov-2 ген orf1a/b имел высокое значение ct (> 36 ct), процент ¬роросостал 4% (→ 1). 한편, BGI SARS-COV-2 유전자 ORF1A/B의 분석에서 CT 값이 높았으며 그 중 비율은 4%였다 (도 1).짐 한편, BGI SARS-COV-2 검출에서 CT 값이 높은 ORF1A/B 유전자의 백분율은 4%이다 (도 1). с другой стороны, В анализе bgi sars-cov-2 процент генов orf1a/b с с с с с сокими зения녔 (> 36 ct) составил 4% (rр 퍼. 1). 한편, BGI SARS-COV-2 분석에서 CT 값이 높은 ORF1A/B 유전자의 백분율은 4%였다 (도 1).
이 연구에서 우리는 164 개의 비 인두 샘플을 촬영했습니다. 모든 유형의 분석에 대해, 각 제조업체가 권장하는 방법 및 키트를 사용하여 RNA 분리 및 증폭을 수행 하였다.
이 연구는 SARS-COV-2에 대한 Abbott의 테스트가 CRS와 동일한 검출 성능을 가지고 있으며 100% 양성, 음성 및 전체 일치함을 가지고 있음을 보여주었습니다. Cohen의 Kappa 계약은 1.00이며 CRS와의 전액 계약을 나타냅니다. 미국 워싱턴 대학교 (University of Washington)의 유사한 연구에 따르면 SARS-COV-2에 대한 Abbott 테스트의 전반적인 민감도와 특이성은 CDC의 실험실 결정 분석 (LDA)과 비교하여 각각 93% 및 100% 인 것으로 나타났습니다. 11. Abbott SARS-Cov-2 검출 시스템은 N 및 RDRP 유전자의 동시 결합 검출에 기초하여, 두 유전자가 더 민감하기 때문에 오 탐지를 최소화한다. 오스트리아 비엔나에서 열린 연구에 따르면 큰 추출 샘플 부피와 검출 용리액 부피는 희석 효과를 최소화하고 검출 효율을 증가 시켰습니다 13. 따라서, Abbott의 SARS-COV-2 분석에 대한 Abbott의 완벽한 일치는 조합 유전자를 동시에 검출하고, 많은 수의 샘플 (0.5 mL)을 추출하며 다량의 용리액 (40 ㎕)을 사용하는 플랫폼 탐지 시스템과 관련 될 수있다.
우리의 결과는 또한 DAAN 유전자 시험의 검출 성능이 CR의 검출 성능과 거의 동일하다는 것을 보여 주었다. 이는 중국 Huainan의 Anhui University에서 실시 된 연구 14와 100% 긍정적 인 합의에 대한 제조업체의 주장과 일치합니다. 일관된 결과에 대한보고에도 불구하고, 동일한 용기를 재조정 한 후 하나의 샘플은 거짓 음성 이었지만 Abbott SARS-Cov-2 및 Sansure Biotech NCOV-2019 분석에서는 양성이었다. 이것은 다른 유형의 분석에 걸쳐 결과에 가변성이있을 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, China15에서 수행 된 연구에서, DAAN 유전자 분석의 결과는 실험실 정의 된 참조 분석과 비교하여 상당히 달랐다 (p <0.05). 그럼에도 불구하고, China15에서 수행 된 연구에서, DAAN 유전자 분석의 결과는 실험실 정의 된 참조 분석과 비교하여 상당히 달랐다 (p <0.05). 멀 не менее, В иссследовании, проведенном В китае15, результат аналл협 а daan gene gene з з ительно оолся (p <05) · 05). лабораторного эталонно있어 анализа. 그러나 China15의 연구에서 DAAN Gene의 분석 결과는 실험실 참조 분석과 유의하게 다릅니다 (p <0.05).然而 然而, 在中国进行的研究中 15, 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异 (p <0.05)。然而, 在中国进行的研究中 15, 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0.05 однако В иссследовании, проведенном В 관어 Â китае15, результа 감 ы генетического теста Daan з з하십니까 з начительно 갑골 (p <0.05) 탠입니다. сравнению с его этаталон람움 적 끈 rrабораторорн칭 м том. 그러나 China15의 연구에서 DAAN의 유전자 검사 결과는 기준 실험실 테스트와 비교하여 상당히 달랐습니다 (p <0.05).이러한 불일치는 SARS-COV-2를 검출하기위한 기준 테스트의 민감성에 기인 할 수 있으며, 원인을 결정하기위한 추가 연구가 중요 할 수 있습니다.
또한, 본 연구는 CRS와의 SARS-COV-2 BGI 분석의 비교 성능을 평가하여 탁월한 긍정적 백분율 계약 (PPA = 97.9%), 음의 백분율 계약 (NPA = 100%) 및 성별 (OPA)에 의한 전체 백분율 계약을 보여줍니다. ). = 98.8%). 코헨의 카파 값은 좋은 일치를 나타냈다 (k = 0.975). 네덜란드 16과 China15의 연구는 일관된 결과를 보여 주었다. SARS-COV-2 BGI 시험은 10 ㎕의 증폭/검출 용출을 사용한 단일 유전자 (ORF1A/B) 검출 시험이다. 우리의 참조 결과와 우수한 통계적 일치에도 불구하고, 분석은 전체 샘플의 두 개의 양성 샘플 (1.22%)을 놓쳤다. 이것은 환자와 지역 사회 수준 모두에서 전염 역학에 큰 임상 적 영향을 줄 수 있습니다.
이 연구에 포함 된 또 다른 비교 분석은 Sansure Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (RUO) 분석; 전체 매치 비율은 96.3%였습니다. 합의의 강점은 또한 Cohen 's Kappa 값에 의해 결정되었으며, 이는 0.925로 CRS와의 전액 계약을 나타냅니다. 다시 말하지만, 우리의 결과는 중국 창자에있는 Central South University 및 중국 Liuzhou City의 Liuzhou People 's Hospital의 임상 실험실 부서에서 수행 된 연구와 동일합니다. 위의 우수한 통계적 일치가 기록되었지만 카이-제곱 검사 (MacNemar Test)는 Sansure Biotech 분석의 결과가 CRS에 비해 통계적으로 유의 한 차이를 가졌다는 것을 보여 주었다 (p <0.005). 위의 우수한 통계적 일치가 기록되었지만 카이-제곱 검사 (MacNemar Test)는 Sansure Biotech 분석의 결과가 CRS에 비해 통계적으로 유의 한 차이를 가졌다는 것을 보여 주었다 (p <0.005). несмотря на то, что бо бо 울거리 갑골 딘 ay · 뇨 занное выше хорошее어요 (критерий макнемара) показал, что реезультат анали인지 sansure biotech 했자 0,005). 위의 우수한 통계적 합의가 기록되었지만 카이-제곱 테스트 (McNemar test)는 Sansure Biotech 분석의 결과가 CRS에 비해 통계적으로 유의 한 차이를 가졌다는 것을 보여 주었다 (p <0.005).尽管记录了上述良好的统计一致性 尽管记录了上述良好的统计一致性, 但卡方检验 但卡方检验 (MacNemar 检验）) 表明, Sansure Biotech 检测的结果与 crs 相比具有统计学显着差异 − (p <0.005)。尽管 尽管 尽管 了 记录 良好 统计 一致性 一致性 一致性 一致性 检验 (但 检验 检验 检验 检验 检验 检验 용고) (MacNemar 检验 表明 表明,, Sansure Biotech 检测 结果 与 与 crs 相比 具有 显着 显着 显着 显着 显着 显着 显着 显着 显着 结果 结果 ∎ 뇨 엽) несмотря на отеченное в : хорошее стататати칭 сооответствие, критерий хи-квадрат (критерий ма 버) Âz® статист젤, зн 제공은 разницу (p <0,005) между анализом Sansure Biotech и crs. 위에서 언급 한 우수한 통계적 합의에도 불구하고, 카이-제곱 테스트 (McNemar test)는 Sansure Biotech Assay와 CRS 사이에 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.005)를 보여 주었다.6 개의 샘플 (3.66%)은 CRS와 비교하여 잘못된 음성 인 것으로 밝혀졌다 (보충 표 1). 이것은 특히 바이러스의 전염의 역학을 고려할 때 매우 중요합니다. 위의 데이터는 또한이 낮은 검출 속도도 지원합니다.
이 연구에서, CT 값은 각각의 분석 및 각각의 플랫폼에 대해 결정되었으며, Abbott SARS-COV-2 분석에서 가장 낮은 평균 CT 값이보고되었다. 이 결과는 SARS-COV-2의 검출을위한 Abbott의 동시 결합 유전자 검사 시스템과 관련이있을 수 있습니다. 따라서,도 1에 따르면, Abbott SARS-COV-2 결과의 87.6%는 CT 값이 20 미만을 가졌다. 소수의 샘플 결과 (12.4%) 만 20-30 범위에 있었다. 30 이상의 CT 값은 기록되지 않았습니다. Abbott의 SARS-COV-2 패널 유전자 검사 형식을 사용하는 것 외에도,이 결과는 낮은 검출 한계 (32.5 RNA 카피/ml) 18과 관련이있을 수 있으며, 이는 회사의 100 RNA 카피/ml보다 3 배 낮습니다. ML) 19.
이 연구에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 자원 부족으로 인해 표준/기준 방법 [바이러스 부하 또는 기타 실험실 테스트 (LDA)]가 없습니다. 둘째,이 연구에 사용 된 모든 표본은 비 인두 면봉이었고, 결과는 다른 시편 유형에 적용되지 않았으며, 셋째, 샘플 크기는 작았습니다.
이 연구는 비 인두 샘플을 사용한 SARS-COV-2에 대한 4 개의 RRT-PCR 분석의 성능을 비교 하였다. 모든 검출 분석은 Sansure 생명 공학 분석을 제외하고는 거의 비슷한 성능을 가졌다. 게다가, 낮은 양성 비율은 CRS와 비교하여 산저 생명 공학 분석에서 확인되었다 (p <0.05). 게다가, 낮은 양성 비율은 CRS와 비교하여 산저 생명 공학 분석에서 확인되었다 (p <0.05). кроме того, В тесте 산업 생물체 biotech ectы절 выявлен ни다는 процент положительных резульататататота은 (p <05). 또한, Sansure Biotech 테스트는 CRS와 비교하여 낮은 비율의 양성 결과를 보여 주었다 (p <0.05).此外, 与 CRS 相比 相比, SANSURE BIOTECH 检测的阳性率较低 (P <0.05)。此外, 与 CRS 相比 相比, SANSURE BIOTECH 检测的阳性率较低 (P <0.05)。 кроме того, анализ 산업 생물학적 바이오 테크 имел более н했다. 또한, Sansure Biotech 분석은 CRS에 비해 양성 속도가 낮았다 (P <0.05).PPA, NPA 및 전체 계약의 Sansure Biotech NCOV-2019 (RUO) 분석은 0.925의 Cohen Kappa 강도로 93.5%를 초과했습니다. 마지막으로, Sansure Biotech Assay (RUO)는 에티오피아에서 사용하기위한 추가 검증이 필요하며, 개별 제조업체의 청구를 평가하기 위해 추가 연구를 고려해야합니다.
비교 연구 설계는 Addis Ababa, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Center, Zewooditu Memorial Hospital 및 St. Peter 's Tuberculosis Specialist Hospital에서 4 개의 건강 시설에서 수행되었습니다. 데이터는 2020 년 12 월 1 일에서 31 일 사이에 수집되었습니다.이 연구의 의료 시설은 많은 사례와 도시의 주요 치료 센터의 가용성에 따라 의도적으로 선택되었습니다. 마찬가지로, ABI 7500 및 Abbott M2000 실시간 PCR 기기를 포함한기구는 NAAT 시약 제조업체의 권장 사항에 따라 선택되었으며, 에티오피아의 대부분의 실험실이 적어도 4 개 이상을 사용했기 때문에이 연구를 위해 4 개의 PCR 검출 키트가 선택되었습니다. 유전자 테스트, Abbott SARS-COV-2 테스트, Sansure Biotech Test 및 SURTED 동안 수행 된 SARS-COV-2 BGI 테스트).
SARS-COV-2에 대한 테스트는 2020 년 12 월 1 일부터 30 일까지 3mL의 바이러스 수송 배지 (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Shenzhen)를 사용하여 EPHI를 언급했습니다. 비 인두 샘플은 훈련 된 샘플 수집기에 의해 수집되어 트리플 팩으로 EPHI로 보냈습니다. 핵산 분리 전에 각 샘플에는 고유 식별 번호가 할당됩니다. 수동 및 자동 추출 방법을 사용하여 도착하자마자 즉시 각 샘플로부터 추출이 수행된다. 따라서, Abbott M2000의 자동 추출을 위해, 샘플의 1.3 ml (0.8 mL 사망 부피 및 0.5 mL 추출 흡입 부피 포함)를 각 샘플로부터 추출하고 Abbott DNA 샘플 제조 시스템 (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, USA)을 통과시켰다. ) 96 개 배치 [92 개의 샘플, 2 개의 검출 대조군 및 2 개의 비 템플릿 컨트롤 (NTC)]이 실시간으로 2 라운드의 SARS-COV-2 (EUA)의 전체 프로세스 (검색 및 검출)에 포함되었습니다. 채광. 마찬가지로 수동 추출의 경우 동일한 샘플 (자동 추출 및 발견을 위해)을 사용하십시오. 따라서, 공정 전반에 걸쳐, 140 ㎕ 샘플을 9 라운드에 걸쳐 24 개 (20 개의 샘플, 2 개의 분석 대조군 및 2 개의 NTC 포함)로 QIAAMP 바이러스 RNA 미니 키트 (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 분취니다. SARS-COV-2 BGI 분석, DAAN 유전자 분석 및 SANSURE BIOTECH 분석을 사용하여 ABI 7500 열 사이클러를 사용하여 수동으로 추출 된 용리를 증폭시키고 검출 하였다.
SARS-COV-2 바이러스 RNA의 자동 분리 및 정제는 Abbott DNA 샘플 제조 시약을 사용하여 자기 비드 원리를 따릅니다. 샘플의 불 활성화 및 바이러스 입자의 가용화는 단백질을 변성시키고 RNase를 불 활성화시키기 위해 구아니딘 이소 티오 시아 네이트를 함유하는 세제를 사용하여 수행된다. 이어서, 실리카를 사용하여 고체 분리에 의해 RNA를 단백질로부터 분리하고, 즉 구아니 디늄 염 및 용해 완충액의 알칼리성 pH는 실리카에 핵산의 결합을 촉진한다 (SIO2). 헹굼 단계는 남아있는 단백질과 잔해를 제거하여 명확한 용액을 생성합니다. 투명한 RNA는 기기의 자기장 20,21을 사용하여 실리카 기반 미세 입자로부터 분리된다. 한편, RNA의 수동 분리 및 정제는 자기 스탠드 대신 원심 분리 및 용리액으로부터의 미세 입자 분리를 사용하여 스핀 컬럼 방법에 의해 수행된다.
Abbott 실시간 SARS-COV-2 검출 테스트 (Abbott Molecular, Inc.)는 WHO와 FDA로부터 EUA19,22를받은 제조업체의 지시에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서, 추출 전 샘플 불 활성화는 56 ℃에서 30 분 동안 수조에서 수행되었다. 바이러스 불 활성화 후, Abbott M2000 DNA 샘플 제조 시스템을 사용하여 0.5 mL VTM의 Abbott M2000 SP 기기에서 핵산 추출을 수행 하였다. 제조업체에 따르면. Abbott M2000 RT-PCR 기기를 사용하여 증폭 및 검출을 수행하고, RDRP 및 N 유전자에 대해 이중 검출을 수행 하였다. 내부 대조군의 표적화 및 검출을위한 Rox) 및 Vic P (독점 염료), 두 증폭 생성물의 동시 검출을 허용한다.
이 키트의 증폭 감지 방법은 1 단계 RT-PCR 기술을 기반으로합니다. ORF1A/B 및 N 유전자는 표적 영역 증폭을 검출하기 위해 DAAN 유전자 기술에 의해 보존 된 영역으로서 선택되었다. 특정 프라이머 및 형광 프로브 (FAM으로 표지 된 N 유전자 프로브, VIC로 표지 된 ORF1A/B 프로브)는 샘플에서 SARS-COV-2 RNA를 검출하도록 설계되었다. 최종 용리액 및 마스터 믹스는 5 ㎕의 용리액을 20 ㎕의 마스터 믹스에 25 ㎕의 최종 부피에 첨가함으로써 제조되었다. ABI 750024 실시간 PCR 기기에서 증폭 및 검출을 동시에 수행 하였다.
ORF1A/B 및 N 유전자는 Sansure Biotech NCOV-2019 핵산 진단 키트 (형광 PCR 검출)를 사용하여 검출되었다. ORF1A/B 영역의 FAM 채널 및 N 유전자의 ROX 채널을 선택하여 각 표적 유전자에 대한 특정 프로브를 준비하십시오. 이 분석 키트에, 용리액 및 마스터 믹스 시약은 다음과 같이 첨가된다 : 검출/증폭을 위해 30 μL 마스터 믹스 시약 및 20 ㎕ 용리 된 샘플을 준비하십시오. 실시간 PCR ABI 750025를 증폭/검출에 사용 하였다.
SARS-COV-2 BGI 테스트는 COVID-19의 진단을위한 형광등 실시간 RRT-PCR 키트입니다. 표적 영역은 단일 유전자 검출 방법 인 SARS-COV-2 게놈의 ORF1A/B 영역에 위치한다. 또한, 인간 하우스 키핑 유전자 β- 액틴은 내부적으로 조절 된 표적 유전자이다. 마스터 믹스는 웰 플레이트 26에서 20 ㎕의 마스터 믹스 시약과 10 ㎕의 추출 된 RNA 샘플을 혼합하여 제조된다. ABI 7500 형광 정량적 실시간 PCR 기기를 증폭 및 검출에 사용 하였다. 모든 핵산 증폭, 각 분석에 대한 PCR 실행 조건 및 결과의 해석은 각각의 제조업체의 지시에 따라 수행되었다 (표 3).
이 비교 분석에서, 우리는 참조 표준 방법을 사용하여 4 가지 분석에 대한 퍼센트 계약 (양성, 음성 및 전체) 및 기타 비교 매개 변수를 결정하지 않았습니다. 각 시험 비교는 CRS로 수행되었으며,이 연구에서 CRS는 규칙 "모든 긍정적"에 의해 설정되었으며 결과는 단일 테스트가 아니라 적어도 두 개의 일치 테스트 결과를 사용했습니다. 또한, CovID-19 전송의 경우, 잘못된 음성 결과는 잘못된 양성 결과보다 더 위험합니다. 따라서, CRS 결과로부터 가능한 한 정확하게 "긍정적"을 말하면, 적어도 두 개의 분석 시험은 긍정적이어야한다. 즉, 적어도 하나의 긍정적 인 결과는 EUA 분석에서 발생할 수 있음을 의미한다. 따라서, 4 개의 테스트 결과 중에서 동일한 결과를 제공하는 둘 이상의 테스트 결과는 진정한 양의 또는 음성으로 간주됩니다 18,27.
구조화 된 데이터 추출 양식을 사용하여 데이터를 수집했으며, 데이터 입력 및 분석을 설명 통계에 대해 Excel 통계 소프트웨어 및 SPSS 버전 23.0을 사용하여 수행 하였다. 양성, 음성 및 전체 퍼센트 합의를 분석하고 Kappa 점수를 사용하여 각 방법의 CRS와의 계약 정도를 결정했습니다. 카파 값은 다음과 같이 해석됩니다. 경미한 계약의 경우 0.01 ~ 0.20, 일반 계약의 경우 0.21 ~ 0.40, 중간 계약의 경우 0.41-0.60, 주요 계약의 경우 0.61-0.80, 완전한 계약의 경우 0.81-0.99.
윤리적 허가는 Addis Ababa 대학교에서 얻었 으며이 연구의 모든 실험 프로토콜은 에티오피아 공중 보건 연구소의 과학 윤리 검토위원회의 승인을 받았습니다. EPHI 윤리 라이센스의 참조 번호는 EPHI/IRB-279-2020입니다. 모든 방법은 COVID-19의 치료를위한 에티오피아 국가 포괄적 인 지침의 권고 및 조항에 따라 적용되었습니다. 또한, 연구에 참여하기 전에 모든 연구 참가자로부터 서면 사전 동의를 얻었습니다.
이 연구에서 얻거나 분석 된 모든 데이터는이 공개 된 기사에 포함되어 있습니다. 이 연구의 결과를 지원하는 데이터는 합리적인 요청시 각 저자로부터 제공됩니다.
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