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2019년 코로나바이러스 질병(COVID-19) 발생 이후 많은 상용 핵산 증폭 검사(NAAT)가 전 세계적으로 개발되어 표준 분석법이 되었습니다.여러 테스트가 빠르게 개발되어 실험실 진단 테스트에 적용되었지만 이러한 테스트의 성능은 다양한 설정에서 평가되지 않았습니다.따라서 본 연구는 Composite Reference Standard(CRS)를 사용하여 Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI 및 Sansure Biotech 검사의 성능을 평가하는 것을 목표로 했습니다.이 연구는 2020년 12월 1일부터 30일까지 에티오피아 공중 보건 연구소(Ethiopian Public Health Institute, EPHI)에서 수행되었습니다. QIAamp RNA 미니 키트와 Abbott DNA 샘플 준비 시스템을 사용하여 비인두 샘플 164개를 추출했습니다.164개 표본 중 CRS에 대해 59.1%가 양성이었고 40.9%가 음성이었다. Sansure Biotech 양성률은 CRS에 비해 유의하게 낮았습니다(p<0.05). Sansure Biotech 양성률은 CRS에 비해 유의하게 낮았습니다(p<0.05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech의 양성 결과는 CRS에 비해 현저히 낮았습니다(p<0.05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低(p < 0.05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低(p < 0.05). У Sansure Biotech는 CRS에 대한 연구를 수행했습니다(p < 0,05). Sansure Biotech는 CRS에 비해 긍정적인 결과가 훨씬 적었습니다(p < 0.05).네 가지 분석의 전체 일치도는 CRS와 비교하여 96.3–100%였습니다.Sansure Biotech 분석의 낮은 양성률 외에도 네 가지 분석의 성능은 거의 비슷했습니다.따라서 Sansure Biotech[RUO(Research Only)] 분석은 에티오피아에서 사용하기 위해 추가 검증이 필요합니다.마지막으로 적절한 제조업체의 주장으로 분석법을 평가하기 위해 추가 연구가 고려되어야 합니다.
실험실 테스트는 세계보건기구(WHO)의 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19) 대비 및 대응(SPRP) 전략 계획의 일부입니다.WHO는 각국이 공중 보건 문제에 대한 대비, 적절한 사례 관리, 경계 및 신속한 대응을 개선하기 위해 실험실 역량을 구축해야 한다고 조언합니다.이것은 실험실의 역할이 새로운 감염원의 질병 및 역학을 특성화하고 확산을 통제하는 데 핵심임을 시사합니다.
COVID-19 진단에는 역학 및 의료 정보, 개인 증상/징후, 방사선 및 실험실 데이터2가 필요합니다.중국 우한에서 COVID-19 발병이 보고된 이후 전 세계적으로 많은 상용 핵산 증폭 검사(NAAT)가 개발되었습니다.실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(rRT-PCR)은 중증 급성 호흡기 증후군 2(SARS-CoV-2)3 감염의 실험실 진단을 위한 일상적이고 표준적인 방법으로 사용되었습니다.SARS-CoV-2의 분자 검출은 일반적으로 ORF1a/b(오픈 리딩 프레임 1a/b)의 N(뉴클레오캡시드 단백질 유전자), E(외피 단백질 유전자) 및 RdRp(RNA 의존성 RNA 중합효소 유전자) 유전자를 기반으로 합니다. .유전자) 바이러스 게놈에서 확인된 영역.이들은 바이러스 인식을 위한 바이러스 게놈에서 발견되는 주요 보존 영역으로 간주됩니다4.이 유전자 중 RdRp와 E 유전자는 분석 검출 민감도가 높은 반면 N 유전자는 분석 민감도가 낮습니다5.
PCR 분석의 성능은 추출 시약, 증폭/검출 시약, 추출 방법, PCR 기계 및 기타 기기의 품질과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다.2020년 4월 현재 9개국에서 48개 이상의 다양한 진단 장치가 COVID-196 진단에 대한 긴급 사용 승인(EUA)을 받았습니다.에티오피아에서는 ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 및 Quant-studio7을 포함하여 26개 공중 보건 기관에서 SARS-CoV-2의 PCR 검출을 위해 14개 이상의 실시간 PCR 플랫폼이 사용됩니다.이 밖에도 다안진 테스트, 애보트 SARS-CoV-2 테스트, 산슈어 바이오텍 테스트, SARS-CoV-2 BGI 테스트 등 다양한 PCR 테스트 키트가 준비되어 있다.rRT-PCR은 매우 민감하지만 일부 COVID-19 환자는 부적절한 수집, 운송, 보관 및 취급, 실험실 테스트로 인해 샘플의 바이러스 리보핵산(RNA) 사본이 부족하여 잘못된 음성 결과를 보고합니다.직원의 조건 및 행동8.또한 샘플 또는 대조군의 잘못된 취급, 주기 역치(Ct) 설정, 다른 병원성 핵산 또는 비활성/잔류 SARS-CoV-2 RNA와의 교차 반응성은 rRT-PCR9 분석에서 위양성 결과를 초래할 수 있습니다.따라서 PCR 검사는 실제로 활성화된 바이러스 유전자를 구별할 수 없기 때문에 실제로 유전자 조각의 운반체를 식별할 수 있다는 것이 분명합니다. 따라서 검사는 환자가 아닌 운반체만 식별할 수 있습니다10.따라서 우리 환경에서 표준 방법을 사용하여 진단 성능을 평가하는 것이 중요합니다.많은 NAAT 시약이 에티오피아 공중 보건 연구소(Ethiopian Public Health Institute, EPHI)와 전국적으로 이용 가능하지만, 그 효과에 대한 비교 평가는 아직 보고되지 않았습니다.따라서 이 연구는 임상 검체를 사용하여 rRT-PCR로 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 시판되는 키트의 비교 성능을 평가하는 것을 목표로 했습니다.
COVID-19가 의심되는 총 164명의 참가자가 이 연구에 포함되었습니다.대부분의 샘플은 치료 센터(118/164 = 72%)에서 나온 반면 나머지 46명(28%)의 참가자는 비치료 센터에서 나왔습니다.센터에서 치료를 받지 않은 참여자 중 15명(9.1%)은 임상적으로 의심되는 사례가 있었고 31명(18.9%)은 확진자와 접촉한 적이 있었다.93명(56.7%)의 참가자가 남성이었고, 참가자의 평균(±표준편차) 연령은 31.10(±11.82)세였습니다.
이 연구에서는 COVID-19에 대한 4가지 테스트의 양성률과 음성률을 결정했습니다.따라서 Abbott SARS-CoV-2 분석, Daan Gene 2019-nCoV 분석, SARS-CoV-2 BGI 분석 및 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석의 양성률은 각각 59.1%, 58.5%, 57.9% 및 55.5%였습니다. .양성 및 음성 종합 참조 표준(CRS) 점수는 각각 97점(59.1%) 및 67점(40.9%)이었습니다(표 1).본 연구에서 CRS의 정의는 4개의 검사 결과 중 동일한 결과를 나타내는 2개 이상의 검사 결과를 참양성 또는 음성으로 간주하는 "모든 양성" 규칙에 기반을 두고 있습니다.
이 연구에서 우리는 CRS와 비교하여 모든 분석에서 100%(95% CI 94.6–100)의 음수 일치율(NPA)을 발견했습니다.Sansure Biotechnology 분석은 93.8%(95% CI 87.2-97.1)의 최소 PPA를 보였고 Daan Gene 2019-nCoV 분석은 99.4%(95% CI 96.6-99.9)의 전체 일치도를 보였습니다.대조적으로, SARS-CoV-2 BGI 분석과 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석 간의 전반적인 일치도는 각각 98.8%와 96.3%였습니다(표 2).
CRS와 Abbott SARS-CoV-2 분석 결과 간의 Cohen의 카파 일치 계수는 완전히 일치했습니다(K = 1.00).유사하게, Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI, Sansure Biotech 2019-nCoV에 의해 검출된 Cohen's kappa 값도 CRS와 완전히 일치합니다(K ≥ 0.925).이번 비교 분석에서 카이제곱 검정(McNemar 검정)을 통해 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석 결과가 CRS 결과와 유의미한 차이를 보였다(p=0.031)(표 2).
도 1에 도시된 바와 같이1 Abbott SARS-CoV-2 분석(RdRp 및 N 유전자 결합)의 최저 Ct 값(< 20 Ct)의 백분율은 87.6%였으며 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 백분율 Ct 값(< 20 Ct)은 50.3%이고 높은 Ct 값(36-40 Ct)은 3.2%였습니다. 1 Abbott SARS-CoV-2 분석(RdRp 및 N 유전자 결합)의 최저 Ct 값(< 20 Ct)의 백분율은 87.6%였으며 Sansure Biotech 2019-nCoV 분석의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 백분율 Ct 값(< 20 Ct)은 50.3%이고 높은 Ct 값(36-40 Ct)은 3.2%였습니다.도 1에 도시된 바와 같이1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составляляло 50,3%, а высокое значение Ct(36–40 Ct) составляло 3,2%. 1에서 Abbott SARS-CoV-2(RdRp와 N 유전자 조합)의 최저 Ct 값(< 20 Ct) 분석의 백분율은 87.6%였으며, Sansure Biotech 2019-nCoV의 ORF1a/b 유전자 분석의 Ct 값은 낮은 Ct 값(< 20 Ct)의 비율은 50.3%를 차지하고 높은 값의 Ct(36–40 Ct)는 3.2%를 차지합니다.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 倽Ct值(< 20 Ct) 에서 50.3%, 高Ct 에서(36–40 Ct) 에서 3.2%. 그림 1에서 볼 수 있듯이 Abbott SARS-CoV-2 테스트(RdRp와 N 유전자 조합)의 최저 Ct 값 백분율(< 20 Ct)은 87.6%이며, Sansure Biotech 2019-nCoV 테스트의 ORF1a/b 유전자 Ct 값은 낮은 Ct(< 20 Ct) 비율은 50.3%, 높은 Ct(36–40 Ct) 비율은 3.2%입니다. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 - Анализ nCoV показал низкий Ct. 그림 1에서 볼 수 있듯이 Abbott SARS-CoV-2 분석(RdRp 및 N 유전자 결합)은 87.6%로 가장 낮은 비율의 Ct 값(< 20 Ct)을 나타냈으며 Sansure에서 ORF1a/b 유전자의 Ct 값은 Biotech 2019 연구 – nCoV 분석 결과 낮은 Ct가 나타났습니다. 프리미엄(< 20 Ct) 소스 50,3%, 프리미엄 Ct(36–40 Ct) 소스 3,2%. 값(< 20 Ct)의 백분율은 50.3%이고 높은 Ct 값(36–40 Ct)의 백분율은 3.2%입니다.Abbott SARS-CoV-2 B 테스트는 30 이상의 Ct 값을 기록했습니다. 한편, BGI SARS-CoV-2 분석에서 ORF1a/b 유전자는 높은 Ct 값(> 36 Ct)을 가졌으며 백분율은 4%였습니다(그림 1). 한편, BGI SARS-CoV-2 분석에서 ORF1a/b 유전자는 높은 Ct 값(> 36 Ct)을 가졌으며 백분율은 4%였습니다(그림 1). С другой стороны, онализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составлял 4% (рис. 1). 한편, BGI SARS-CoV-2 유전자 분석에서 ORF1a/b는 높은 Ct 값(> 36 Ct)을 가졌으며 그 비율은 4%였습니다(그림 1).BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）. 한편, BGI SARS-CoV-2 검출에서 Ct 값이 높은(>36 Ct) ORF1a/b 유전자의 비율은 4%입니다(그림 1). С другой стороны, analyze BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис. 1). 한편, BGI SARS-CoV-2 분석에서 Ct 값이 높은(>36 Ct) ORF1a/b 유전자의 비율은 4%였다(도 1).
이 연구에서 우리는 164개의 비인두 샘플을 채취했습니다.모든 유형의 분석에 대해 각 제조업체에서 권장하는 방법 및 키트를 사용하여 RNA 분리 및 증폭을 수행했습니다.
이 연구는 SARS-CoV-2에 대한 Abbott의 테스트가 100% 양성, 음성 및 전반적인 일치로 CRS와 동일한 탐지 성능을 가지고 있음을 입증했습니다.Cohen의 kappa 일치는 1.00으로 CRS와 완전히 일치함을 나타냅니다.미국 워싱턴 대학의 유사 연구에서는 SARS-CoV-2에 대한 Abbott 테스트의 전반적인 민감도와 특이도가 CDC의 LDA(Laboratory-Determined Assay)와 비교하여 각각 93% 및 100%인 것으로 나타났습니다. .11. Abbott SARS-CoV-2 검출 시스템은 N 및 RdRp 유전자의 동시 결합 검출을 기반으로 합니다. 두 유전자 모두 더 민감하여 위음성을 최소화하기 때문입니다12.오스트리아 비엔나에서 실시한 연구에서도 많은 양의 추출 시료와 검출 용리액 양이 희석 효과를 최소화하고 검출 효율을 높인 것으로 나타났습니다13.따라서 SARS-CoV-2 분석에 대한 Abbott의 완벽한 일치는 조합 유전자를 동시에 감지하고 많은 수의 샘플(0.5ml)을 추출하며 많은 양의 용리액(40µl)을 사용하는 플랫폼 감지 시스템과 연관될 수 있습니다.
우리의 결과는 또한 Daan 유전자 검사의 탐지 성능이 CRS와 거의 동일하다는 것을 보여주었습니다.이것은 중국 Huainan의 Anhui University에서 수행된 연구14와 제조업체의 100% 긍정적 동의 주장과 일치합니다.일관된 결과 보고에도 불구하고, 한 샘플은 동일한 용출액을 재검사한 후 위음성이었지만 Abbott SARS-CoV-2 및 Sansure Biotech nCoV-2019 분석에서는 양성이었습니다.이것은 다양한 유형의 분석에 걸쳐 결과에 변동성이 있을 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 중국에서 수행된 연구15에서 Daan Gene 분석의 결과는 실험실 정의 참조 분석과 비교하여 유의미한 차이(p < 0.05)를 보였습니다. 그럼에도 불구하고 중국에서 수행된 연구15에서 Daan Gene 분석의 결과는 실험실 정의 참조 분석과 비교하여 유의미한 차이(p < 0.05)를 보였습니다. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторнолого. 그러나 중국의 한 연구15에서 Daan Gene의 분석 결과는 실험실 참조 분석과 유의미한 차이(p < 0.05)를 보였습니다.然而，中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p<0.05）。然而，中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0.05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. 그러나 중국의 한 연구15에서 Daan의 유전자 검사 결과는 기준 실험실 검사와 비교하여 유의미한 차이(p < 0.05)를 보였습니다.이러한 불일치는 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 참조 테스트의 민감도 때문일 수 있으며 원인을 파악하기 위해서는 추가 연구가 중요할 수 있습니다.
또한, 우리 연구는 CRS와 SARS-CoV-2 BGI 분석의 비교 성능을 평가했으며, 우수한 양성 일치율(PPA = 97.9%), 음성 일치율(NPA = 100%), 성별에 따른 전반적인 일치율( 오파).).= 98.8%).Cohen의 Kappa 값은 좋은 일치를 보였다(K = 0.975).네덜란드16와 중국15에서의 연구는 일관된 결과를 보여주었습니다.SARS-CoV-2 BGI 테스트는 10µl 증폭/검출 용출액을 사용하는 단일 유전자(ORF1a/b) 검출 테스트입니다.참조 결과와 통계적으로 잘 일치했음에도 불구하고 분석에서는 전체 샘플 중 2개의 양성 샘플(1.22%)이 누락되었습니다.이것은 환자와 지역 사회 수준 모두에서 전송 역학에 대해 큰 임상적 의미를 가질 수 있습니다.
이 연구에 포함된 또 다른 비교 분석은 Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR(RUO) 분석이었습니다.전체 일치율은 96.3%였습니다.일치 강도는 Cohen's Kappa 값으로 결정되었으며 0.925로 CRS와 완전히 일치함을 나타냅니다.다시 말하지만, 우리의 결과는 중국 창사에 있는 Central South University와 중국 Liuzhou시 Liuzhou People's Hospital의 임상 실험실 부서에서 수행된 연구와 동일합니다17. 위의 좋은 통계적 일치도를 기록했지만, 카이제곱 검정(MacNemar 검정)에서는 Sansure Biotech 분석 결과가 CRS와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났습니다(p<0.005). 위의 좋은 통계적 일치도를 기록했지만, 카이제곱 검정(MacNemar 검정)에서는 Sansure Biotech 분석 결과가 CRS와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났습니다(p<0.005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). 위의 좋은 통계적 일치가 기록되었지만 카이제곱 검정(McNemar 검정)에서는 Sansure Biotech 분석 결과가 CRS와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 보여주었습니다(p<0.005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS 相比具有统计学显着差异0（p < ）尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果 与 crs 相比 具有 显。。。（0。。。。。 0.5。。。。 ...)))) Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. 위에서 언급한 우수한 통계적 일치에도 불구하고 카이제곱 검정(McNemar 검정)은 Sansure Biotech 분석과 CRS 사이에 통계적으로 유의미한 차이(p < 0.005)를 보여주었습니다.CRS와 비교하여 6개의 샘플(3.66%)이 위음성인 것으로 나타났습니다(보충 표 1).이것은 특히 바이러스 전파 역학을 고려할 때 매우 중요합니다.위의 데이터도 이러한 낮은 탐지율을 뒷받침합니다15.
이 연구에서 Ct 값은 Abbott SARS-CoV-2 분석에서 보고된 가장 낮은 평균 Ct 값으로 각 분석 및 각 플랫폼에 대해 결정되었습니다.이 결과는 SARS-CoV-2 검출을 위한 Abbott의 동시 복합 유전자 검사 시스템과 관련이 있을 수 있습니다.따라서 그림 1에 따르면 Abbott SARS-CoV-2 결과의 87.6%가 Ct 값이 20 미만이었습니다. 샘플 결과의 소수(12.4%)만이 20-30 범위에 있었습니다.30 이상의 Ct 값은 기록되지 않았습니다.Abbott가 SARS-CoV-2 패널 유전자 검사 형식을 사용하는 것 외에도, 이 결과는 회사의 하한인 100 RNA copies보다 3배 낮은 검출 한계(32.5 RNA copies/mL)18와 관련이 있을 수 있습니다. /mL.ml)19.
이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 리소스 부족으로 인해 [바이러스 부하 또는 기타 실험실 테스트(LDA)와 같은] 표준/참조 방법이 없습니다.둘째, 본 연구에 사용된 검체는 모두 비인두도말 표본이었으며, 다른 검체 유형에는 해당 결과가 적용되지 않았으며, 셋째, 표본 크기가 작았다.
이 연구는 비인두 샘플을 사용하여 SARS-CoV-2에 대한 4가지 rRT-PCR 분석의 성능을 비교했습니다.모든 검출 분석은 Sansure Biotech 분석을 제외하고 거의 비슷한 성능을 보였습니다. 또한 Sansure Biotech assay는 CRS에 비해 낮은 양성률을 보였다(p < 0.05). 또한 Sansure Biotech assay는 CRS에 비해 낮은 양성률을 보였다(p < 0.05). Chrome того, в тесте Sansure Biotech는 CRS에 대한 연구를 수행했습니다(p < 0,05). 또한 산슈어 바이오텍 검사는 CRS에 비해 낮은 양성률을 보였다(p<0.05).외, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测의 阳性率较低(p < 0.05).외, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测의 阳性率较低(p < 0.05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). 또한 Sansure Biotech assay는 CRS에 비해 양성률이 낮았다(p<0.05).PPA, NPA 및 전체 일치에 대한 Sansure Biotech nCoV-2019(RUO) 분석은 Cohen Kappa 일치 강도 값 0.925로 93.5%를 초과했습니다.마지막으로 RUO(Sansure Biotech Assay)는 에티오피아에서 사용하기 위해 추가 검증이 필요하며 개별 제조업체의 주장을 평가하기 위해 추가 연구가 고려되어야 합니다.
비교 연구 디자인은 Addis Ababa, Eka Kotebe 병원, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial 병원 및 St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital에 있는 4개의 의료 시설에서 수행되었습니다.데이터는 2020년 12월 1일부터 31일 사이에 수집되었습니다. 본 연구를 위한 의료 시설은 환자 수가 많고 시내 주요 치료 센터의 가용성을 고려하여 의도적으로 선택되었습니다.유사하게 ABI 7500 및 Abbott m2000 실시간 PCR 장비를 포함한 장비는 NAAT 시약 제조업체의 권장 사항에 따라 선택되었으며, 에티오피아의 대부분의 실험실에서 최소한 최소 그들 중 네.유전자 검사, Abbott SARS-CoV-2 검사, Sansure Biotech 검사, SARS-CoV-2 BGI 검사가 연구 중에 수행됨).
SARS-CoV-2에 대한 테스트는 2020년 12월 1일부터 30일까지 EPHI로 언급된 COVID-19에 대해 조사 중인 개인의 VTM(Viral Transport Medium)(Miraclean Technology, 중국 선전) 3ml를 사용하여 수행되었습니다.비인두 샘플은 숙련된 샘플 수집가가 수집하여 3중 팩으로 EPHI로 보냈습니다.핵산을 분리하기 전에 각 샘플에 고유 식별 번호가 할당됩니다.수동 및 자동 추출 방법을 사용하여 도착 즉시 각 샘플에서 추출이 수행됩니다.따라서, Abbott m2000의 자동 추출을 위해 각 시료에서 1.3ml(dead volume 0.8ml 및 추출 주입구 부피 0.5ml 포함)의 시료를 추출하여 Abbott DNA Sample Preparation System(Abbott Molecular Inc. des Plaines, 일리노이, 미국).) 실시간으로 SARS-CoV-2(EUA) 2회차의 전체 프로세스(검색 및 검출)에 96개[샘플 92개, 검출 컨트롤 2개 및 비템플릿 컨트롤(NTC) 2개]의 배치가 포함되었습니다.채광.마찬가지로 수동 추출의 경우 동일한 샘플을 사용합니다(자동 추출 및 검색용).따라서 전체 과정에서 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 9회에 걸쳐 24개(샘플 20개, 분석 컨트롤 2개 및 NTC 2개 포함) 배치로 140µl 샘플을 분주하고 추출했습니다.수동으로 추출한 용출액은 SARS-CoV-2 BGI 분석, Daan Gene 분석 및 Sansure Biotech 분석을 사용하는 ABI 7500 열 순환기를 사용하여 증폭 및 검출되었습니다.
SARS-CoV-2 바이러스 RNA의 자동 분리 및 정제는 Abbott DNA 샘플 준비 시약을 사용하는 자기 비드 원리를 따릅니다.샘플의 불활성화 및 바이러스 입자의 가용화는 단백질을 변성시키고 RNase를 불활성화시키기 위해 구아니딘 이소티오시아네이트를 함유하는 세제를 사용하여 수행됩니다.그런 다음 RNA는 실리카를 사용한 고상 분리에 의해 단백질에서 분리됩니다. 즉, 구아니디늄 염과 용해 완충액의 알칼리성 pH는 핵산과 실리카(SiO2)의 결합을 촉진합니다.헹굼 단계는 남아있는 단백질과 파편을 제거하여 투명한 용액을 생성합니다.투명 RNA는 기기의 자기장20,21을 사용하여 실리카 기반 미립자에서 분리됩니다.한편, RNA의 수동 분리 및 정제는 자성 스탠드 대신 원심분리를 이용하여 용리액에서 미립자를 분리하는 스핀 컬럼 방법으로 수행됩니다.
Abbott 실시간 SARS-CoV-2 탐지 테스트(Abbott Molecular, Inc.)는 WHO 및 FDA로부터 EUA19,22를 받은 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다.이 프로토콜에서는 추출 전 샘플 비활성화를 56°C의 수조에서 30분 동안 수행했습니다.바이러스 불활성화 후, Abbott m2000 DNA 샘플 준비 시스템을 사용하여 0.5ml VTM으로부터 Abbott m2000 SP 기기에서 핵산 추출을 수행했습니다.제조업체에 따르면.Abbott m2000 RT-PCR 기기를 사용하여 증폭 및 검출을 수행하였고, RdRp 및 N 유전자에 대해 이중 검출을 수행하였다.ROX) 및 내부 컨트롤의 표적화 및 검출을 위한 VIC P(독점 염료)를 사용하여 두 증폭 제품을 동시에 검출할 수 있습니다 19 .
본 키트의 증폭 검출 방식은 one-step RT-PCR 기술을 기반으로 합니다.ORF1a/b 및 N 유전자는 표적 영역 증폭을 검출하기 위해 Daan Gene Technology에 의해 보존 영역으로 선택되었습니다.특정 프라이머 및 형광 프로브(FAM으로 라벨링된 N 유전자 프로브, VIC로 라벨링된 ORF1a/b 프로브)는 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하도록 설계되었습니다.최종 용리액과 마스터 믹스는 용리액 5 μl를 마스터 믹스 20 μl에 추가하여 최종 부피가 25 μl가 되도록 준비했습니다.증폭 및 검출은 ABI 750024 실시간 PCR 기기에서 동시에 수행되었습니다.
ORF1a/b 및 N 유전자는 Sansure Biotech nCoV-2019 핵산 진단 키트(형광 PCR 검출)를 사용하여 검출되었습니다.ORF1a/b 영역에 대한 FAM 채널과 N 유전자에 대한 ROX 채널을 선택하여 각 표적 유전자에 대한 특정 프로브를 준비합니다.이 분석 키트에 다음과 같이 용리액 및 마스터 믹스 시약을 추가합니다. 검출/증폭을 위해 30µl 마스터 믹스 시약과 20µl 용출 샘플을 준비합니다.실시간 PCR ABI 750025를 증폭/검출에 사용했습니다.
SARS-CoV-2 BGI 테스트는 COVID-19 진단을 위한 형광 실시간 rRT-PCR 키트입니다.대상 영역은 단일 유전자 검출 방식인 SARS-CoV-2 게놈의 ORF1a/b 영역에 위치한다.또한, 인간 하우스키핑 유전자 β-액틴은 내부적으로 조절되는 표적 유전자이다.마스터 믹스는 마스터 믹스 시약 20µl와 추출된 RNA 샘플 10µl를 웰 플레이트에서 혼합하여 준비합니다26.ABI 7500 형광 정량 실시간 PCR 기기를 증폭 및 검출에 사용했습니다.모든 핵산 증폭, 각 분석에 대한 PCR 실행 조건 및 결과 해석은 각 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다(표 3).
이 비교 분석에서는 네 가지 분석에 대한 일치율(양성, 음성 및 전체) 및 기타 비교 매개변수를 결정하기 위해 참조 표준 방법을 사용하지 않았습니다.각 테스트 비교는 CRS로 수행되었으며, 이 연구에서 CRS는 "모든 양성" 규칙에 의해 설정되었고 결과는 단일 테스트가 아니라 적어도 두 개의 일치하는 테스트 결과를 사용하여 결정되었습니다.또한 COVID-19 전파의 경우 위음성 결과가 위양성 결과보다 더 위험합니다.따라서 CRS 결과에서 가능한 한 정확하게 "양성"이라고 말하기 위해서는 최소 2개의 분석 테스트가 양성이어야 합니다.따라서 4개의 테스트 결과 중 동일한 결과를 제공하는 2개 이상의 테스트 결과는 참 양성 또는 음성으로 간주됩니다18,27.
구조화된 데이터 추출 형식을 사용하여 데이터를 수집하고 Excel 통계 소프트웨어 및 기술 통계용 SPSS 버전 23.0을 사용하여 데이터 입력 및 분석을 수행했습니다.양성, 음성, 전체 백분율 일치도를 분석하였고, 각 방법이 CRS와 일치하는 정도를 결정하기 위해 Kappa 점수를 사용하였다.Kappa 값은 0.01~0.20은 경미한 일치, 0.21~0.40은 일반적, 0.41~0.60은 보통 일치, 0.61~0.80은 주요 일치, 0.81~0.99는 완전 일치로 해석된다28.
아디스아바바 대학교에서 윤리 허가를 받았으며 이 연구에 대한 모든 실험 프로토콜은 에티오피아 공중 보건 연구소의 과학 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다.EPHI 윤리 라이선스의 참조 번호는 EPHI/IRB-279-2020입니다.모든 방법은 COVID-19 치료를 위한 에티오피아 국가 종합 지침의 권장 사항 및 조항에 따라 적용되었습니다.또한 연구에 참여하기 전에 모든 연구 참여자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.
이 연구에서 얻거나 분석한 모든 데이터는 이 출판된 기사에 포함되어 있습니다.이 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터는 합당한 요청이 있는 경우 각 작성자에게 제공됩니다.
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게시 시간: Dec-08-2022