PCR 반응의 간섭 요인

PCR 반응 동안, 일부 간섭 요인이 종종 발생합니다.
PCR의 매우 높은 감도로 인해 오염은 PCR 결과에 영향을 미치는 가장 중요한 요소 중 하나로 간주되며 잘못된 양성 결과를 생성 할 수 있습니다.
거짓 음성 결과로 이어지는 다양한 출처도 마찬가지로 중요합니다. PCR 혼합물의 하나 이상의 필수 부분 또는 증폭 반응 자체가 억제되거나 방해되는 경우, 진단 분석을 방해 할 수 있습니다. 이로 인해 효율이 감소하고 잘못된 부정적인 결과를 초래할 수 있습니다.
억제 이외에, 표본 핵산 무결성의 손실은 샘플 준비 전에 운송 및/또는 저장 조건으로 인해 발생할 수있다. 특히, 고온 또는 부적절한 저장은 세포와 핵산의 손상을 유발할 수 있습니다. 세포 및 조직 고정 및 파라핀 임베딩은 DNA 단편화의 잘 알려진 원인이며 지속적인 문제입니다 (그림 1 및 2 참조). 이 경우 최적의 분리 및 정제조차도 도움이되지 않습니다.

그림 1 | 고정화가 DNA 완전성에 미치는 영향
아가 로스 겔 전기 영동은 부검의 파라핀 섹션으로부터 분리 된 DNA의 품질이 상당히 다양하다는 것을 보여 주었다. 고정 방법에 따라 추출물에 상이한 평균 단편 길이의 DNA가 존재 하였다. DNA는 천연 냉동 샘플 및 완충 된 중성 포르말린에 고정 된 경우에만 보존되었다. 강하게 산성 부인 고정 성 고정성 또는 부패되지 않은 포름산-함유 포르말린의 사용은 DNA의 상당한 손실을 초래 하였다. 나머지 분획은 매우 단편화됩니다.
왼쪽에서 단편의 길이는 킬로베이스 쌍 (KBP)으로 표현됩니다.

그림 2 | 핵산 표적의 완전성 상실
(a) 두 가닥의 3'-5 '갭은 표적 DNA에서 파괴를 초래할 것이다. DNA의 합성은 여전히 ​​작은 조각에서 발생합니다. 그러나, DNA 단편에서 프라이머 어닐링 부위가 누락되는 경우, 선형 증폭 만 발생합니다. 가장 유리한 경우, 단편은 서로를 조화시킬 수 있지만 수율은 작고 검출 수준 이하입니다.
(b) 주로 탈사 및 티미 딘 이량 체 형성으로 인한 염기의 손실은 H- 결합 수의 감소 및 TM의 감소를 초래한다. 길쭉한 온난화 단계에서 프라이머는 매트릭스 DNA에서 녹이고 덜 엄격한 조건에서도 어닐링하지 않습니다.
(c) 인접한 흉선 염기는 TT 이량 체를 형성한다.
분자 진단에서 종종 발생하는 또 다른 일반적인 문제는 페놀 클로로포름 추출과 비교하여 표적 핵산의 최적이지 않은 방출입니다. 극단적 인 경우, 이것은 잘못된 부정과 관련이있을 수 있습니다. 세포 잔해의 끓는 용해 또는 효소 소화로 인해 많은 시간을 절약 할 수 있지만,이 방법은 종종 핵산 방출 불충분함에 따라 낮은 PCR 감도를 초래합니다.

증폭 동안 중합 효소 활성의 억제

일반적으로, 억제는 차선책 결과를 초래하는 모든 요인을 설명하기위한 컨테이너 개념으로 사용된다. 엄격하게 생화학 적 의미에서, 억제는 효소의 활성으로 제한되며, 즉, DNA 폴리머 라제의 활성 부위와의 상호 작용 (예 : TAQ DNA 폴리머 라제의 경우 MG2+)의 활성 부위와의 상호 작용을 통해 기질-생산 전환을 감소 시키거나 방지한다.
시약을 함유하는 샘플 또는 다양한 완충제 및 추출물의 성분은 효소를 직접 억제하거나 보조 인자 (예 : EDTA)를 억제하여 중합 효소를 불 활성화시키고 차례로 감소 또는 거짓 음성 PCR 결과를 초래할 수 있습니다.
그러나, 반응 성분과 표적 함유 핵산 사이의 많은 상호 작용도 'PCR 억제제'로 지정된다. 세포의 무결성이 분리에 의해 파괴되고 핵산이 방출되면, 샘플과 주변 용액과 고체 상 사이의 상호 작용이 발생할 수있다. 예를 들어, 'Scavengers'는 비공유 상호 작용을 통해 단일 또는 이중 가닥 DNA에 결합 할 수 있으며 결국 PCR 반응 용기에 도달하는 표적의 수를 줄임으로써 분리 및 정제를 방해 할 수 있습니다.
일반적으로, PCR 억제제는 임상 진단 검사 (소변, 헤모글로빈 및 혈액의 우레아),식이 보충제 (유기 성분, 글리코겐, 지방, CA2+ 이온) 및 환경 (Phenols, 중금속)에 사용되는 대부분의 체액 및 시약에 존재합니다.

더 널리 퍼진 PCR 억제제는 박테리아 및 진핵 세포, 비 표적 DNA, 조직 매트릭스의 DNA 결합 거대 분자 및 장갑 및 플라스틱과 같은 실험실 장비에서 발견 될 수있다. 추출 동안 또는 후에 핵산의 정제는 PCR 억제제를 제거하기위한 바람직한 방법이다.
오늘날, 다양한 자동 추출 장비는 많은 수동 프로토콜을 대체 할 수 있지만 100% 회복 및/또는 대상 정화는 결코 달성되지 않았습니다. 잠재적 억제제는 여전히 정제 된 핵산에 존재하거나 이미 발효되었을 수 있습니다. 억제제의 영향을 줄이기위한 다른 전략이 존재한다. 적절한 중합 효소의 선택은 억제제 활성에 상당한 영향을 줄 수있다. PCR 억제를 감소시키는 다른 입증 된 방법은 폴리머 라제 농도를 증가 시키거나 BSA와 같은 첨가제를 적용하고있다.
PCR 반응의 억제는 내부 프로세스 품질 관리 (IPC)의 사용에 의해 입증 될 수있다.
철저한 세척 단계에 의해 핵산 분리 물에서 에탄올, EDTA, CETAB, GUSCN, SDS, ISOPROPANOL 및 PHENOL과 같은 추출 키트에서 모든 시약 및 기타 용액을 제거해야합니다. 농도에 따라 PCR을 활성화 시키거나 억제 할 수 있습니다.