PCR 반응의 간섭 요인

PCR 반응 과정에서 종종 몇 가지 방해 요인이 발생합니다.
PCR 검사는 민감도가 매우 높기 때문에 오염은 PCR 결과에 영향을 미치는 가장 중요한 요인 중 하나로 간주되며, 위양성 결과를 초래할 수 있습니다.
마찬가지로 중요한 것은 위음성 결과를 초래하는 다양한 원인입니다. PCR 혼합물의 필수 구성 요소 또는 증폭 반응 자체의 하나 이상의 구성 요소가 저해되거나 방해를 받으면 진단 검사가 제대로 수행되지 못할 수 있습니다. 이는 효율성 저하 및 위음성 결과로 이어질 수 있습니다.
저해 작용 외에도, 시료 준비 전 운송 및/또는 보관 조건으로 인해 표적 핵산의 완전성이 손상될 수 있습니다. 특히, 고온이나 부적절한 보관 조건은 세포와 핵산의 손상을 초래할 수 있습니다. 세포 및 조직 고정과 파라핀 포매는 DNA 단편화의 잘 알려진 원인이며 지속적인 문제입니다(그림 1 및 2 참조). 이러한 경우, 최적의 분리 및 정제 과정을 거치더라도 소용이 없습니다.

그림 1 | 고정화가 DNA 무결성에 미치는 영향
아가로스 겔 전기영동 분석 결과, 부검 시 파라핀 절편에서 분리한 DNA의 품질은 상당히 다양했다. 고정 방법에 따라 추출물에 존재하는 DNA 단편의 평균 길이가 달랐다. DNA는 자연 냉동 상태의 시료와 중성 완충 포르말린으로 고정했을 때만 보존되었다. 강산성 부앵 고정액이나 완충되지 않은 포름산 함유 포르말린을 사용했을 경우에는 DNA 손실이 상당했다. 남은 DNA는 심하게 단편화된 상태였다.
왼쪽에는 단편의 길이가 킬로베이스 쌍(kbp)으로 표시되어 있습니다.

그림 2 | 핵산 표적의 무결성 손실
(a) 양쪽 가닥 모두에서 3'-5' 간격이 생기면 표적 DNA가 끊어지게 됩니다. 이 작은 조각에서도 DNA 합성은 계속 일어납니다. 그러나 DNA 조각에 프라이머 결합 부위가 없으면 선형 증폭만 발생합니다. 가장 유리한 경우, 조각들이 서로 재포화될 수 있지만, 그 수율은 낮아 검출 한계 이하가 될 것입니다.
(b) 염기 손실은 주로 탈퓨린화 및 티미딘 이량체 형성에 의해 발생하며, 이는 수소 결합 수 감소 및 Tm 감소로 이어집니다. 장시간 가열 단계 동안 프라이머는 기질 DNA에서 분리되어 덜 엄격한 조건에서도 어닐링되지 않습니다.
(c) 인접한 티민 염기는 TT 이합체를 형성합니다.
분자 진단에서 흔히 발생하는 또 다른 문제는 페놀-클로로포름 추출법에 비해 표적 핵산의 추출이 최적화되지 않는다는 점입니다. 극단적인 경우, 이는 위음성으로 이어질 수 있습니다. 세포 파편을 끓여 용해시키거나 효소적으로 분해하는 방법은 시간을 크게 절약할 수 있지만, 핵산 추출이 불충분하여 PCR 민감도가 낮아지는 경우가 많습니다.

증폭 과정 중 중합효소 활성 억제

일반적으로 저해는 PCR 결과가 최적화되지 못하게 하는 모든 요인을 설명하는 포괄적인 개념으로 사용됩니다. 엄밀히 말하면 생화학적 관점에서 저해는 효소 활성에 국한되며, 즉 DNA 중합효소 또는 그 보조인자(예: Taq DNA 중합효소의 경우 Mg2+)의 활성 부위와의 상호작용을 통해 기질-생성물 전환을 감소시키거나 방해하는 것을 의미합니다.
시료 또는 시약을 포함하는 다양한 완충액 및 추출물의 구성 요소는 효소를 직접 억제하거나 보조 인자(예: EDTA)를 포획하여 중합효소를 비활성화시키고 결과적으로 PCR 결과의 감소 또는 위음성을 초래할 수 있습니다.
하지만 반응 구성 요소와 표적 핵산을 포함하는 물질 간의 많은 상호작용은 'PCR 억제제'로도 불립니다. 세포 분리 과정에서 세포의 완전성이 손상되어 핵산이 방출되면, 시료와 주변 용액 및 고체상 사이의 상호작용이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, '스캐빈저'는 비공유 결합을 통해 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA에 결합하여 PCR 반응 용기에 도달하는 표적의 수를 줄임으로써 분리 및 정제 과정을 방해할 수 있습니다.
일반적으로 PCR 억제제는 대부분의 체액과 임상 진단 검사에 사용되는 시약(소변의 요소, 혈액의 헤모글로빈 및 헤파린), 식이 보충제(유기 성분, 글리코겐, 지방, Ca2+ 이온) 및 환경 성분(페놀, 중금속)에 존재합니다.

흔히 발견되는 PCR 저해제는 박테리아 및 진핵 세포, 비표적 DNA, 조직 기질의 DNA 결합 거대 분자, 그리고 장갑이나 플라스틱과 같은 실험 장비에서 찾아볼 수 있습니다. 추출 과정 중 또는 추출 후 핵산을 정제하는 것이 PCR 저해제를 제거하는 데 가장 적합한 방법입니다.
오늘날 다양한 자동 추출 장비가 많은 수동 프로토콜을 대체할 수 있지만, 목표물의 100% 회수 및/또는 정제는 아직 달성되지 않았습니다. 잠재적인 저해제가 정제된 핵산에 여전히 존재하거나 이미 작용했을 수 있습니다. 저해제의 영향을 줄이기 위한 다양한 전략이 존재합니다. 적절한 중합효소의 선택은 저해제의 활성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. PCR 저해를 줄이는 다른 입증된 방법으로는 중합효소 농도를 높이거나 BSA와 같은 첨가제를 사용하는 것이 있습니다.
PCR 반응의 억제는 내부 공정 품질 관리(IPC)를 사용하여 입증할 수 있습니다.
추출 키트에 포함된 에탄올, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, 이소프로판올, 페놀 등의 모든 시약 및 기타 용액은 철저한 세척 과정을 통해 핵산 분리물에서 완전히 제거해야 합니다. 이러한 물질들은 농도에 따라 PCR을 활성화하거나 억제할 수 있습니다.