PCR 반응의 간섭 요인

PCR 반응 중에 일부 간섭 요인이 자주 발생합니다.
PCR의 민감도가 매우 높기 때문에 오염은 PCR 결과에 영향을 미치는 가장 중요한 요인 중 하나로 간주되며 위양성 결과를 초래할 수 있습니다.
위음성 결과를 초래하는 다양한 소스도 마찬가지로 중요합니다. PCR 혼합물의 하나 이상의 필수 부분 또는 증폭 반응 자체가 억제되거나 방해를 받는 경우 진단 분석이 방해받을 수 있습니다. 이로 인해 효율성이 저하되고 심지어 잘못된 음성 결과가 나올 수도 있습니다.
억제 외에도 시료 준비 전 배송 및/또는 보관 조건으로 인해 표적 핵산 무결성의 손실이 발생할 수 있습니다. 특히 온도가 높거나 보관이 부적절할 경우 세포와 핵산이 손상될 수 있습니다. 세포 및 조직 고정과 파라핀 포매는 잘 알려진 DNA 단편화의 원인이자 지속적인 문제입니다(그림 1 및 2 참조). 이러한 경우 최적의 분리 및 정제도 도움이 되지 않습니다.

그림 1 | 고정화가 DNA 무결성에 미치는 영향
아가로스 겔 전기영동은 부검의 파라핀 부분에서 분리된 DNA의 품질이 상당히 다양하다는 것을 보여주었습니다. 고정 방법에 따라 다양한 평균 단편 길이의 DNA가 추출물에 존재했습니다. DNA는 기본 냉동 샘플과 완충된 중성 포르말린에 고정된 경우에만 보존되었습니다. 강산성 Bouin 고정제 또는 완충되지 않은 포름산 함유 포르말린을 사용하면 DNA가 크게 손실되었습니다. 나머지 부분은 매우 조각화되어 있습니다.
왼쪽에는 조각의 길이가 킬로베이스 쌍(kbp)으로 표시됩니다.

그림 2 | 핵산 표적의 무결성 상실
(a) 두 가닥의 3'-5' 간격으로 인해 표적 DNA가 파손됩니다. DNA 합성은 여전히 ​​작은 조각에서 발생합니다. 그러나 DNA 단편에 프라이머 어닐링 부위가 없으면 선형 증폭만 발생합니다. 가장 유리한 경우에는 조각이 서로 재포화될 수 있지만 수율은 작고 검출 수준보다 낮습니다.
(b) 주로 탈퓨린화 및 티미딘 이량체 형성으로 인한 염기 손실은 H-결합 수의 감소와 Tm의 감소를 초래합니다. 연장된 온난화 단계 동안 프라이머는 매트릭스 DNA에서 녹아 떨어져 덜 엄격한 조건에서도 어닐링되지 않습니다.
(c) 인접한 티민 염기는 TT 이합체를 형성합니다.
분자 진단에서 자주 발생하는 또 다른 일반적인 문제는 페놀-클로로포름 추출에 비해 표적 핵산의 방출이 최적이 아니라는 것입니다. 극단적인 경우 이는 거짓 부정과 연관될 수 있습니다. 끓이는 세포 찌꺼기의 용해 또는 효소 분해를 통해 많은 시간을 절약할 수 있지만, 이 방법은 핵산 방출이 부족하여 PCR 민감도가 낮아지는 경우가 많습니다.

증폭 중 중합효소 활성 억제

일반적으로 억제는 최적이 아닌 PCR 결과를 초래하는 모든 요인을 설명하는 컨테이너 개념으로 사용됩니다. 엄격한 생화학적 의미에서 억제는 효소의 활성으로 제한됩니다. 즉, DNA 중합효소 또는 보조 인자(예: Taq DNA 중합효소의 경우 Mg2+)의 활성 부위와의 상호작용을 통해 기질-산물 전환이 감소하거나 방지됩니다.
시료의 구성 요소나 시약이 포함된 다양한 완충액 및 추출물은 효소를 직접적으로 억제하거나 보조 인자(예: EDTA)를 포획하여 중합효소를 비활성화하고 결과적으로 PCR 결과가 감소하거나 위음성으로 이어질 수 있습니다.
그러나 반응 성분과 표적 함유 핵산 사이의 많은 상호작용도 'PCR 억제제'로 지정됩니다. 분리로 인해 세포의 무결성이 파괴되고 핵산이 방출되면 샘플과 주변 용액 및 고체상 사이의 상호 작용이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, '스캐빈저'는 비공유 상호작용을 통해 단일 또는 이중 가닥 DNA에 결합할 수 있으며 결국 PCR 반응 용기에 도달하는 표적 수를 줄여 분리 및 정제를 방해할 수 있습니다.
일반적으로 PCR 억제제는 임상 진단 테스트(소변의 요소, 혈액의 헤모글로빈 및 헤파린), 식이 보충제(유기 성분, 글리코겐, 지방, Ca2+ 이온) 및 환경 성분(페놀)에 사용되는 대부분의 체액 및 시약에 존재합니다. , 중금속)

보다 널리 사용되는 PCR 억제제는 박테리아 및 진핵 세포, 비표적 DNA, 조직 매트릭스의 DNA 결합 거대분자, 장갑 및 플라스틱과 같은 실험실 장비에서 찾을 수 있습니다. 추출 중 또는 추출 후 핵산을 정제하는 것이 PCR 억제제를 제거하는 데 선호되는 방법입니다.
오늘날 다양한 자동 추출 장비가 많은 수동 프로토콜을 대체할 수 있지만 대상의 100% 복구 및/또는 정제는 결코 달성되지 않았습니다. 잠재적인 억제제가 정제된 핵산에 여전히 존재할 수도 있고 이미 효과가 나타날 수도 있습니다. 억제제의 영향을 줄이기 위한 다양한 전략이 존재합니다. 적절한 중합효소의 선택은 억제제 활성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. PCR 억제를 줄이는 다른 입증된 방법은 중합효소 농도를 높이거나 BSA와 같은 첨가제를 적용하는 것입니다.
PCR 반응의 억제는 내부 공정 품질 관리(IPC)를 사용하여 입증할 수 있습니다.
철저한 세척 단계를 통해 핵산 분리물에서 에탄올, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, 이소프로판올 및 페놀과 같은 추출 키트의 모든 시약 및 기타 용액을 제거하려면 주의를 기울여야 합니다. 농도에 따라 PCR을 활성화하거나 억제할 수 있습니다.